刺槐根瘤菌新种(Mesorhizobium robiniae)及共生体系强化植物对锌污染土壤的生物修复作用

锌是常见的有毒污染物质，也是比较容易进入环境的重金属之一。较高浓度的锌将对土壤-植物系统产生危害，导致土壤退化、作物产量和品质降低，通过食物链污染农产品和威胁人畜健康。如何有效地进行锌污染土壤的生态修复是一项重要的课题。本项目拟通过分离自木本豆科植物刺槐、对重金属锌有较强耐受性并具有共生固氮能力的中慢生根瘤菌新种（Mesorhizobium robiniae sp. nov.）对锌的吸附特性、抗性机理和共生固氮体系的生长发育、结瘤固氮能力对重金属胁迫的响应以及共生固氮体系对锌污染土壤的生物修复效果等研究，揭示刺槐根瘤菌及其共生体系对锌污染土壤的生物修复作用机制。该研究将为农业环境保护及矿区废弃地生态恢复和重建提供理论依据和途径。

中慢生根瘤菌Mesorhizobium amorphae CCNWGS0123分离自甘肃铅锌尾矿的刺槐，具有较强的铜、锌、镍、铬耐受性。吸附等温线拟合发现，该菌株对Cr (III) 、Cr (VI)及Zn2+离子的理论吸附量分别为53.52 mg/ L 、47.67 mg /L和120.85 mg /L，并在酸性溶液中呈现70-80%的解析率。傅里叶红外光谱分析表明，羟基、羧基、胺基等基团参与了菌体表面三种离子的结合。. 全基因组测序及分析发现，来自P型 ATP酶、 MntH、 CDF、 HupE/UreJ及 CHR等蛋白家族的转运蛋白参与该菌株对铜、锌、镍、铬抗性及内稳态调控。通过chrA::LacZ融合表达发现铬酸根离子可诱导M. amorphae菌株的chrA与外源β-半乳糖苷酶共表达。通过基因插入△chrA和△chrB突变体构进行铬离子敏感性检测。借助ICP-MS测定M. amorphae野生型和突变型菌株铬累积能力表明，ChrA蛋白在铬酸根离子的外排和降低菌体细胞内铬酸根毒害方面发挥着重要作用。转座子突变结果表明，编码Cu (II) 转运的P-type ATPase的copA-6910 基因被打断，极大地降低了菌株对铜的抗性。结合 RT-PCR进一步证明，CusB和CopA-6910共同负责菌株对铜的抗性。此外，突变体 34-28 被敲除基因参与细胞色素c氧化酶 cbb3 -Cox。该系统在微生物固氮等厌氧生物过程中起着非常重要的作用。根据突变体34-28对 Cu（II）较强的敏感性推测，ccmX可能与Cu 参与 cbb3细胞色素c 氧化酶系统中的催化过程有关。. 促植物生长实验发现，M. amorphae菌株CCNWGS0123并不具有产生 IAA、铁载体及 ACC 脱氢酶活性。共生结瘤实验表明，菌株 M. amorphae 野生型及△chrA，3-42和34-28均可与宿主植物共生结瘤；而突变体34-28由于缺失CcmX，形成的根瘤多为无效瘤。盆栽试验表明，M. amorphae野生型菌株可在50 mg/kgCr(VI)和200mg/kg Cu（II）胁迫下与宿主植物共生、结瘤、固氮，增加生物量。表明M. amorphae所携带的重金属抗性基因可间接强化宿主植物在污染土壤中的稳定性，更显著的辅助提高植物对金属的吸收能力。