负载PrP肽的树突状细胞治疗小鼠朊病毒病过程中T细胞受体库变化谱的研究

Prion diseases are fatal neurodegenerative diseases, that can infect human and animals, featuring long incubation period and short course. There is no effective therapy till now. Since prion is conformationally converted from a cellular protein, PrPC, which mainly expressed within central nervous system, it cannot be recognized by the immune system, namely immune tolerance. The latest research indicated that intraperitoneal injection of PrP97-128 peptide-loaded dendritic cells into wild type mice could overcome tolerance, therefore retarded disease duration, and even protected mice from prion attack. This represents the most effective administration by far. In order to unravel the molecular mechanisms underlying the immunotherapy mentioned, we plan to detect the activity of cellular immune responses and the changes of T cell receptor repertoire upon the stages of before infection, incubation period and after-onset or devoid of disease. Briefly, cellular immunoactivities will be represented by the number of INF gamma-secreted T cells using ELISPOT assay, the entire TCR repertoire will be deciphered by the next generation sequencing applying Solexa sequencer. Then a series of bioinformatics analysis including the identification and typing of TCR genes, estimation of the preference of V/J recommbination, and the analyses of the diversity of CDR3 region will be performed. Through the comparison of TCR repertoire profiles of different samples, we are going to highlight the specific TCRs related to the immunotherapy. Our study would provide useful data to uncover the molecular mechanisms of the therapy and develop the new therapeutic vaccines of prion diseases.

朊病毒病是一类侵袭人和多种动物的致死性神经退行性疾病，潜伏期长，病程短，致死率100%，目前无有效治疗方法。朊病毒由中枢神经系统中PrPC蛋白构象转变而成，与PrPC氨基酸序列一致，因此感染后不能被机体免疫系统识别，处于免疫耐受状态。最新研究表明负载PrP97-128肽的树突状细胞注入野生型小鼠体内可激发免疫反应，能延长潜伏期甚至保护小鼠不发病。这是目前结果最好的免疫治疗尝试。为揭示该治疗模型中细胞免疫的分子机制，本研究拟利用上述治疗模型，通过检测杀伤性T细胞数目来观测感染前、潜伏期中以及不同转归小鼠的细胞免疫反应强度，并通过Solexa高通量测序对T细胞受体（TCR）库进行测定，利用生物信息学方法寻找TCR CDR3的变化规律，再通过比较不同转归小鼠的TCR谱寻找免疫治疗相关的特异性TCR。本研究将为朊病毒病免疫治疗分子机制提供重要的数据，为开发治疗性疫苗奠定基础。

朊病毒病是一类侵袭人和多种动物的致死性神经退行性疾病，潜伏期长，病程短，致死率100%，目前无有效治疗方法。.本项目建立了小鼠TCR建库及测序技术平台，初步了解了正常小鼠α链和β链的VJ序列分布特点。利用多种方法对朊病毒感染的啮齿类动物模型脑组织及朊病毒感染细胞系SMB-S15中相关蛋白和通路的变化与朊病毒致病作用的相关性进行了研究。证实了在体内和体外PLK3和PrP蛋白存在相互作用，不仅全长的PLK3可以与PrP发生相互作用，PLK3蛋白N端的激酶区（kinase domain，KD）和C端的Polo盒子区（Polo-box domain，PBD）也能与PrP发生相互作用。发现高浓度的PLK3可以降解细胞中突变PrP蛋白，但对野生型PrP蛋白的表达量影响不大。这种降解作用依赖于PLK3蛋白的KD区，而与PBD区无关。敲降PLK3可以明显增加PrP突变蛋白的水平。利用蛋白酶体和自噬溶酶体抑制剂处理后发现，蛋白酶体抑制剂和巨自噬抑制剂对PLK3介导的PrP突变体的降解作用无明显影响，而溶酶体途径抑制剂能明显阻断PLK3对PrP突变体的降解作用，提示该降解作用依赖于溶酶体途径。在表达PrP突变体的HEK293T细胞和羊瘙痒因子感染的SMB-S15细胞中，分子伴侣介导的自噬（CMA）核心成分，溶酶体相关膜蛋白2A（LAMP2）及热休克类蛋白70（HSC70）明显降低，PrP突变体可以与LAMP2和HSC70发生相互作用。过表达PLK3明显增加了细胞内LAMP2a和HSC70的含量，同时伴随着PrP突变体和PrPSc含量的降低。敲降内源性PLK3增加了细胞内巨自噬的活性，而且在263K感染的仓鼠脑组织中可明显观察到随着病程的加深，LAMP2a和HSC70明显降低，提示在朊病毒感染过程中，分子伴侣介导自噬的核心成分受到破坏。.此外，利用本项目的资助课题组发现在朊病毒感染过程中某些蛋白及相关因子呈明显下调，如BNDF和PAKs，发现Wnt信号通路被抑制及AMPK-ULK1通路激活在朊病毒感染中的初步作用及总结了神经退行性疾病基因表达谱的特点。.上述研究成果在SCI收录的国际期刊上发表论文8篇，其中3篇IF>5。培养博士研究生2名，硕博连读研究生1名，硕士研究生3名。.本项目加深了对朊病毒病发病机理的认识，为探索治疗手段提供科学依据。