中华羊茅内生真菌的多样性及生物学特性研究

Festuca sinensis is an important perennial bunchgrass with strong tolerance to drought, cold and salinity in the alpine regions of China and plays an important role in establishment of grassland and restoration of degradation ecosystems. However, F. sinensis has not been widely applied as the shortage of commercial cultivars. It is often affected with Epichloë endophytes which provided the potential to breed improved F. sinensis cultivars with endophytes. The aims of the presented project are to understand the relationship between endophyte and F. sinensis; identification and characterisation of Epichloë endophytes isolated from F. sinensis and discovery and delivery a substantial number of candidate novel endophytes for molecular Festuca sp. pasture breeding. In order to achieve these aims, a collection of different F. sinensis ecotypes from different geographic locations will be screened for the presence of native endophytes. Subsequently, endophyte will be isolated, identified and characterized by morphology, gene phylogeny, chemotyping, mating type and SSR makers. The physiological phenotypes of F. sinensis endophyte associations under stress and natural field will be measured to provide insight about the effects of endophytes on host growth performance. The alkaloids will be also detected to explore the potential effects of associations on livestock. Throughout these efforts, the present project will identify the relationship between endophyte and host and delivery a substantial number of candidate novel endophytes for molecular pasture breeding.

中华羊茅(Festuca sinensis)分布于我国青藏高原等高寒地区，具有抗逆性强，适应性广，适口性好，营养价值高等优良特性，对高寒牧区草地建设、生态治理和畜牧业生产具有重要意义，急需对这一宝贵的种质资源进行开发利用。其常与内生真菌共生，可利用内生真菌的优势进行种质创新与品种选育。本项目拟以不同地理种群的中华羊茅内生真菌共生体为材料，研究内生真菌的形态、系统发育特征、基因多态性和产碱特性以阐明中华羊茅内生真菌的种和多样性；分析内生真菌对共生体生长及抗旱性的影响以揭示内生真菌对寄主的作用；检测共生体生物碱的种类和含量以推断共生体对家畜的潜在影响。该研究将明确中华羊茅内生真菌的种类、产碱特性和对寄主抗逆性的作用，从而在理论上深化对内生真菌的资源多样性以及与寄主相互作用的认识，在实践上为利用内生真菌进行中华羊茅种质创新与品种选育，实现中华羊茅的生产和生态价值奠定基础。

本项目以我国甘肃、四川、青海和西藏等高寒地区采集或收集的中华羊茅内生真菌共生体为材料，从中分离纯化内生真菌46株。详细观察并记录了46株内生真菌包括形状、边缘、光泽、质地在内的菌落形态，正、反面菌落颜色，并根据菌落直径计算生长速度。测定每个菌株的菌丝、分生孢子梗和分生孢子的直径和大小。发现这些菌落存在多样性，但均为Epichloë属内生真菌。根据tubB和tefA的基因序列，利用系统发育学综合分析模式菌株57A的系统进化关系，发现检测的所有克隆序列在系统进化树上分别形成2个独立的分支，揭示了中华羊茅内生真菌是杂交种。综合以上形态学数据和系统进化树结果，认为菌株57A是一个内生真菌新种，命名为Epichloë sinensis。分别提取上述46个中华羊茅内生真菌菌株的DNA，PCR扩增生物碱合成途径中相关基因，推测不同菌株的产碱特性，初步估计中华羊茅内生真菌不产生对家畜有毒的生物碱lolitremB和ergovaline，而产生对昆虫有毒的生物碱peramine。进一步分析中华羊茅内生真菌在不同培养基上的生长速度，筛选出耐盐性和耐金属的内生真菌用于牧草新品种的开发和利用。.在田间和温室建立不同生态型中华羊茅被内生真菌感染（E+）和未被内生真菌感染（E-）种群，通过监测植物生长发现内生真菌促进寄主中华羊茅的生长，但是寄主基因型对共生体的生长也有重要影响。检测到共生体产生高含量的peramine,低含量的lolitrem B和ergovaline生物碱，利用荧光定量PCR技术检测内生真菌在共生体中的浓度，发现内生真菌的浓度并不影响其产生的生物碱浓度。进一步分析在温室干旱和重金属胁迫条件下以及不同环境因素（季节、混播和刈割）下共生体生长表现，发现E+比E-生长情况好，内生真菌提高寄主中华羊茅的抗逆性和对环境的响应，有助于寄主抵抗不良环境的影响；而胁迫条件及环境因素均对共生体生长产生影响并进而影响生物碱含量。通过这一系列温室和田间试验明确了内生真菌对乡土草中华羊茅抗逆性的有益作用和对家畜的潜在影响，为进一步利用内生真菌进行中华羊茅品种选育奠定了基础。