典型病原菌钙蛋白酶的结构与作用机制

Calpains are considered to be papain-like cysteine proteases that require calcium ions for activity. The calpain protein is initially expressed in an inactive form (zymogen) which is proteolytically-processed to create a catalytically-active mature form. Calpains primarily use proteolytic processing, rather than degradation, to modulate or modify their substrates’ activity,specificity, localization, and structure. Calpains could play fundamental roles in many regulatory, developmental and cell-signaling processes, and also play key roles in many infection-related processes of parasites and pathogens. While eukaryotic calpains have been widely studied to date, there are very few studies on the calpains from prokaryotes and none have been structurally characterized. In this proposal, we will establish structure-function relationships to clarify the biological roles of bacterial calpains. This will be done using a focused combination of biochemical, genetic, bioinformatics, microbiological and structural biology approaches. We will characterize the in vitro biochemical activity of representative calpains from Porphyromonas gingivalis, 3 species of Actinomyces, Bacteroides thetaiotaomicron and Mycobacterium fortuitum; determine their crystal structures alone or in complex with bound substrates or inhibitors; examine their roles in response to various bacterial stresses in vivo; and combine structural and functional data to validate calpains as potential drug targets. This project is an example of structural biology contributing to microbial physiology studies and should provide a more complete understanding of the role of calpains in pathogen survival and infection.

钙蛋白酶是一类与木瓜蛋白酶类似的、需要结合钙离子来发挥活性的半胱氨酸蛋白酶，通常具有一种自剪切激活机制，通过对底物蛋白特定位置的切割来改变或修饰其活性、特异性、定位和结构等。钙蛋白酶与多种发育方面的异常和疾病相关，并对寄生虫和病原菌的致病性非常重要。迄今对病原菌钙蛋白酶的结构和功能研究还处于起步阶段。本项目以牙龈卟啉单胞菌、3种放线菌、多形拟杆菌和偶发分支杆菌等6种病原菌的钙蛋白作为研究对象，综合利用微生物学、结构生物学、分子生物学等多种研究方法，解析不同病原菌钙蛋白酶的结构，探讨结构与功能的关系，阐明钙蛋白酶自剪切激活机制以及对各种底物的识别和降解机制，揭示钙蛋白酶在病原菌应对外界营养环境和宿主免疫压力过程中发挥的生理作用，确定潜在的药物靶点，筛选有效抑制物。本项目将结构生物学研究手段应用到微生物生理生化研究，充分体现结构与功能研究相结合的优势，为解决更复杂的微生物学问题奠定基础。

钙蛋白酶是一个大型的半胱氨酸蛋白酶家族，其活性由钙离子的结合而开启。钙蛋白酶在真核生物中发挥着许多重要的生物作用，包括降解与宿主免疫系统有关的蛋白质和肽类。然而，钙蛋白酶在原核生物中的研究仍然不充分。牙龈卟啉菌的硫醇蛋白酶Tpr是细菌钙蛋白酶亚家族中第一个被鉴定的成员，已知它与细胞外膜有关。.在这个项目中，我们研究了几种有代表性的致病菌的钙蛋白酶，包括牙龈卟啉菌W83、HG66，戈氏放线菌DSM 6844、衣氏放线菌DSM 43320、乔格放线菌DSM 6843。我们表达和纯化了细菌钙蛋白酶并测定了它们的活性，表明它们都经历了蛋白水解切割。蛋白质质量指纹图谱和埃德曼测序表明，牙龈卟啉单胞菌Tpr在Gly62和Met63之间进行有限的蛋白水解，形成一个48 kDa的酶 (Tpr48)，然后它被进一步切割成36 kDa (Tpr36)、33kDa (Tpr33)和24 kDa (Tpr24)的形式。Tpr33变体先前已被证明可以水解补体蛋白C3、C4和C5。第一个细菌钙蛋白酶 P. gingivalis W93 Tpr 的三维结构在 pH 6.5、6.9、7.5 和8.5下解析为无Ca2+和负载Ca2+的形式。Tpr结晶为同源三聚体，通过分析超速离心实验证实Tpr在溶液中形成三聚体。Tpr结构在蛋白质的C端有一个核心钙蛋白酶样结构域，以及一个独特的N端区域，它环绕着钙蛋白酶样结构域。Tpr以55 kDa的 "未加工 "酶和N端截断的约45 kDa蛋白的混合物形式表达，后者仍与N端约10 kDa的片段紧密相连。无Ca2+的Tpr结构代表未加工的55 kDa形式，而含有Ca2+的形式代表与N-末端片段结合的成熟的Tpr48变体。催化三联体被确定为Cys229、His406和Asn426。结构分析确定每个Tpr单体有两个钙结合位点，圆二色光谱学证实该蛋白在钙离子结合后是稳定的。活性试验表明，Tpr被蛋白酶抑制剂E64和TLCK抑制，但不被PMSF抑制。此外，Tpr能水解胶原酶底物Pz-肽（PLGPR）。这项工作为深入理解牙龈卟啉单胞菌 Tpr 和细菌钙蛋白酶在感染过程中的机制以及探索它们对机会致病菌进行治疗干预的潜力提供了一个起点。