甲状旁腺激素相关肽在促进骨折愈合中的作用和机制研究

Previous studies have demonstrated that parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) can stimulate bone formation, however. To investigate how PTHrP stimulate bone fracture healing, we will create a closed fracture model at mid-diaphyseal femur, using 2-month-old wild-type (WT) and PTHrP heterozygote（PTHrP+/-）mice. The callus tissue properties will be examined at 1, 2 and 4 weeks post-fracture by radiography, micr-CT, histopathology, cellular and molecular biology to assess whether PTHrP deficiency results in a defect in fracture healing through inhibiting endochondral bone formation and bone turnover, consequently injuring formations of cartilaginous and bony callus. Then we will investigate how exogenous PTHrP N-terminus and PTHrP nuclear localization sequence and C-terminus stimulate bone fracture healing, we will employ above fracture model, mice will receive daily injections of , recombinant PTHrP(1-86) or PTHrP(87-139) for 1-4 weeks post-fracture. Using techniques as described above to assess whether PTHrP(1-86) or PTHrP(87-139) can stimulate bone fracture healing and which is more effective. Results from this study will be helpul to elucidate the mechanism of action of PTHrP in stimulating bone fracture healing, thus will provide experimental and theoretical basis for the clinical study to apply the deffirent fragments of PTHrP in stimulating bone fracture healing.

先前研究证明甲状旁腺素相关肽(PTHrP)具有促骨形成的作用，为了研究PTHrP在促进骨折愈合中的作用及机制，我们将利用2月龄野生型和PTHrP杂合子（PTHrP+/-）小鼠制备股骨干骨折模型，在骨折后1、2和4周，利用影像学、病理组织学及分子生物学方法，观察PTHrP缺乏是否引起软骨性和骨性骨痂形成障碍及骨转换减慢，导致骨折愈合障碍。为了研究外源性PTHrP N-末端和PTHrP 核定位序列和C末端在促进骨折愈合中的作用及机制，采用同样的骨折模型，在骨折后每天皮下注射80μg/kg基因重组PTHrP（1-86）或PTHrP（87-139），利用上述方法，观察能否促进野生型小鼠的骨折愈合，并矫正PTHrP缺乏引起的骨折愈合障碍；比较它们在促进骨折愈合中的不同作用。本研究将有助于阐明PTHrP促进骨折愈合的作用及机制，将为使用PTHrP不同片段在骨折愈合中的临床研究提供实验和理论基础。

在申请者进行的“PTHrP促在骨折愈合中作用与机制”的实验研究中：.第一阶段完成了内源性PTHrP缺失对骨折愈合的影响。.为了明确内源性PTHrP缺乏是否对小鼠骨折愈合有影响，选用8周龄PTHrP野生型(WT)和PTHrP杂合子(PTHrP+/-)小鼠作为实验对象，采用髓内针固定的标准股骨干骨折模型。分别于骨折1周、2周和4周，通过X线、micro-CT等影像学指标和组织学、组织化学和免疫组织化学等方法观察局部软骨性骨痂、软骨性骨痂向骨性骨痂转换、骨性骨痂形成特征；通过real-time RT-PCR和western blot等方法观察骨形成相关基因和蛋白在骨痂形成过程中的表达水平的变化。结果发现：PTHrP内源性缺乏引起骨折愈合障碍，表现为软骨性骨痂形成减少、向骨性骨痂转化减慢，成骨细胞骨形成各项指标包括成骨细胞数、碱性磷酸酶（ALP）和I型胶原（Col-1）阳性面积、碱性磷酸酶和I型胶原基因表达水平、骨钙素的mRNA，以及核心结合因子1(cbfα1)、胰岛素样生长因子I(IGF-I)的蛋白水平都明显降低。.第二阶段完成了外源性PTHrP对骨折愈合的影响的研究实验，主要结果包括两部分。. 第一部分，完成了外源性PTHrP对糖尿病性骨质疏松性骨折愈合的影响的研究实验，实验结果如下：实验模型制作同第一部分研究，选用8周龄野生型(WT)和Lepr-/- (db/db)小鼠作为实验对象，标准股骨干骨折模型制作后，外源性PTHrP给药后，分别于骨折1周、2周和4周，采用第一阶段研究方法和内容。结果显示：糖尿病性骨质疏松小鼠骨折愈合延迟，外源性PTHrP纠正了这一现象，但对野生型小鼠的骨折愈合效果更优。. 第二部分：完成了外源性PTHrP对内源性PTHrP缺失条件下骨折愈合的影响的研究实验，实验模型制作同第一部分研究，外源性PTHrP给药后，采用第一部分研究内容，结果显示：外源性PTHrP纠正了内源性PTHrP缺失引起的骨折愈合障碍，通过上调成骨细胞基因和蛋白表达，促进软骨内骨形成和骨痂改建途径完成。.结论：内源性PTHrP、Lepr-/- (db/db)缺乏减少了骨痂形成面积、软骨内成骨和成骨细胞数量，从而阻碍了或者说延迟了骨折的愈合。而外源性PTHrP通过上调成骨细胞基因和蛋白表达，促进软骨内骨形成和骨痂改建途径完成。.研究结果以论文形式发表。