基于低频同义密码子去优化改造的新型流感减毒活疫苗的研究

Several studies have shown that influenza A virus genome has codon usage bias. However, the overall influence of underrepresented codon usage on viral replication and virulence has not been clearly elucidated. According to codon usage bias of influenza A virus, we design and synthesize de novo gene segments of influenza virus using thousands of underrepresented synonymous codons to encode the influenza proteins. Then, the mutant viruses carrying single or multiple underrepresented synonymous codons gene segments will be rescued by influenza reverse genetic system. The synthetic viruses will be analyzed for their in vitro growth characteristics and plaque phenotype in cell cultures to identify by which scheme or segment combinations could be best attenuated influenza virus in vitro. To test the mutant viruses carrying underrepresented synonymous codons in animals, BALB/c mice and ferrets will be infected intranasally infected and monitored for disease symptoms, median lethal dose and viral titer in lungs. Viral genome transcription and protein translation level in infected whole cell lysates will be tested to explore the molecular mechanism responsible for attenuation. To characterize the protective immunity of the mutant influenza virus in mice and ferrets, the humoral, cellular, mucosal immunity and wild type homologous/heterologous virus challenge protection will be tested in mice model. In summary, our study aim to explore a new approach for developing more stable, safer, and effective live attenuated influenza vaccine by large-scale codon deoptimiaztion of influenza A virus.

流感病毒基因组密码子使用具有特定偏好性。如果采用低频率同义密码子重新编码流感病毒，将会对病毒的毒力与免疫原性等生物学特征有何影响？本研究拟根据A型流感病毒密码子使用规律，在不改变氨基酸编码前提下，用低频率使用密码子同义替换高频率使用密码子，对病毒编码基因进行密码子去优化改造，采用化学合成方法全基因合成密码子同义突变后的基因片段。利用反向遗传技术拯救携带一条或多条密码子去优化改造基因的流感病毒。通过细胞和动物体内病毒复制生长特性、毒力表型等研究，比较以及确定使流感病毒毒力减弱的最佳密码子去优化改造方案，并在基因组转录、蛋白表达水平，以及宿主抗病毒免疫反应等方面对其减毒分子机制进行分析。在小鼠和雪貂模型中评估低频密码子编码流感病毒诱导机体细胞、体液与粘膜免疫应答水平，对同源和异源病毒攻击的保护力。综上，本研究拟通过大规模低频密码子同义突变的方法，探索更安全、有效的新型流感减毒活疫苗制备策略。

病毒的密码子使用偏好在与宿主细胞相互作用的过程中会发生适应性突变。通过改变密码子或密码子对的使用偏好致弱病毒是一个很好的制备减毒活疫苗的策略。本项目以流感病毒为研究对象，根据A型流感病毒密码子使用规律，在不改变氨基酸编码前提下，用低频率使用密码子同义替换高频率使用密码子，对病毒编码基因进行密码子去优化改造，采用化学合成方法全基因合成密码子同义突变后的基因片段。利用反向遗传技术拯救携带一条或多条密码子去优化改造基因的流感病毒。在项目研究期内，我们以H1N1和H7N9流感病毒为背景，获得了携带密码子重编NA片段流感病毒（repNA/PR8）和携带密码子重编NS片段流感病毒(deoNS/H7N9)。此外，我们还成功拯救获得了携带5个密码子重编片段（PB2/HA/NP/NA/NS）的流感病毒（PR8rp），该病毒基因组内共含有1717个沉默突变。PR8rp病毒为目前已有报道中，含有的改造片段最多，编码区改造范围最大的密码子去优化改造流感病毒。通过细胞和动物体内病毒复制生长特性、毒力表型研究，我们发现PR8rp病毒在体外细胞、鸡胚和小鼠体内的复制能力均明显减弱。动物实验表明， PR8rp病毒能够诱导小鼠产生全面且充分的机体免疫应答，1PFU剂量单次免疫即能够对野生型PR8病毒的致死性攻击提供完全保护。令人振奋的是，PR8rp减毒活疫苗对异源病毒攻毒也能够提供完全保护。此外，携带单个基因密码子改造的流感病毒repNA/PR8和deoNS/H7N9也具有显著的体内外减毒表型，并能提供有效的免疫保护应答。基因水平和蛋白表达水平检测发现，通过密码子去优化改造，能够降低改造后的基因片段在病毒基因组中包装含量，降低相应病毒蛋白的表达量及功能，进而使病毒的致病力下降。通过大规模低频密码子同义突变的方法，我们探索更安全、有效的流感减毒活疫苗制备策略，为新型流感疫苗的研发奠定基础。