长链非编码RNA-SNHG3作为ceRNA参与miR-885-5p调控人牙髓干细胞成牙本质样分化中DSPP基因的机制研究

Attributed to the capacity of differentiation into odontoblast-like cells, human dental pulp stem cells (hDPSCs) function as crucial roles in repairment mechanism in dental pulp impairment. As a specific gene of odontoblast differentiation, dentin sialophosphoprotein (DSPP) has been a research hot spot. Microarray analysis and validation results have revealed significant up-regulation of long non-coding RNA-SNHG3 (lncRNA-SNHG3) in hDPSCs when induced into odontoblast at day 14. Based on the binding site prediction of lncRNA-SNHG3 and miR-885-5p and demonstration of negative regulatory effect of miR-885-5p on DSPP by dual-luciferase reporter assay, we propose that lncRNA-SNHG3 may regulate expression of DSPP by sponging miR-885-5p. In this study, we constructed hDPSC cell lines persistently over-/under-expressing lncRNA-SNHG3 or miR-885-5p for analysis of their functions in odontoblast differentiation of hDPSCs. Further, through detection of localization of lncRNA-SNHG3 in hDPSC, we investigate the mechanism of lncRNA-SNHG3 in regulating DSPP via miR-885-5p. This study aims to illuminate the function of lncRNA-SNHG3 in regulating odontoblast differentiation of hDPSCs to provide novel ideas for dental pulp regeneration.

人牙髓干细胞(hDPSCs形成成牙本质样细胞的能力在牙髓损伤再生机制中具有重要意义，且牙本质涎磷蛋白(DSPP)作为检测成牙本质向分化的特异性标记物之一，其调控机制备受关注。芯片结果及验证发现hDPSCs在成牙本质样分化14天时长链非编码RNA-SNHG3显著上调，数据库和基因报告分析发现SNHG3与miR-885-5p存在作用位点，并且荧光素酶报告显示下调表达的miR-885-5p对DSPP存在调控作用。据此推测SNHG3通过吸附miR-885-5p参与对DSPP的调控。本课题拟构建SNHG3和miR-885-5p过/抑制表达的稳定细胞系以分析功能；观察SNHG3的细胞内定位，明确其调控机制；进一步探索SNHG3通过吸附miR-885-5p调控DSPP参与的调控机制。研究旨在阐明SNHG3调控hDPSCs成牙本质样分化的功能及机制，为牙髓再生提供新思路。

牙髓炎是口腔临床上最常见的疾病，但一旦牙髓组织受感染后很难恢复，往往采用去髓术结合根管治疗术，以达到消除感染、保留患牙的目的。但失去牙髓的牙齿由于失去了营养的支持，极易出现折断、变色等并发症。因此，尽可能的保存活髓，促进牙髓组织的再生具有重要的意义。人牙髓干细胞 (hDPSCs) 作为牙组织工程的种子细胞之一，也是迄今为止在牙髓再生研究中得到最多应用的种子细胞。hDPSCs在牙髓组织损伤时能分化为成牙本质样细胞形成修复性牙本质，因此成牙本质样细胞的形成在牙髓损伤再生机制中具有重要意义；而牙本质涎磷蛋白(DSPP)是由成牙本质样细胞分泌的，被认为是检测成牙本质向分化的特异性标记物，其调控机制备受关注。因此，该研究对hDPSCs分化过程中调控DSPP的关键lncRNA及机制进行了探究。首先，采用了人转录基因组芯片检测及体外细胞验证实验发现：hDPSCs在成牙本质样分化14天时长链非编码RNA-SNHG3显著上调，数据库和基因报告分析发现lncRNA-SNHG3与miR-885-5p存在作用位点，并且荧光素酶报告显示下调表达的miR-885-5p对DSPP存在调控作用。体外细胞功能实验、裸鼠体内构建的人牙齿空根管模型牙髓再生的动物模型实验，均验证了miR-885-5p抑制hDPSCs成牙本质及成血管分化。据此后续进行机制探究：荧光原位杂交技术发现lncRNA-SNGH3定位于包质内;荧光素酶报告系统检测与lncRNA-SNGH3结合和靶向DSPP的miRNA为miR-885-5p。最后，通过回复实验构建SNHG3和miR-885-5p过/抑制表达的稳定细胞系，进一步验证lncRNA-SNGH3通过吸附miR-885-5p调控DSPP表达。该课题深入探究hDPSCs的成牙本质样分化过程的具体机制，寻找参与分化过程的关键分子lncRNA-SNHG3及其作用靶点，为牙髓再生提供新思路的同时，也为构建组织工程牙髓-牙本质复合体提供实验研究的基础。