Klotho蛋白拮抗Ca2+内流抑制心肌细胞肥大的机制研究

Myocyte hypertrophy is the initiating factor in heart failure induced by ventricular remodeling. The pathological stimulus-mediated Ca2 + influx in cardiomyocyte is a major mechanism of myocyte hypertrophy, which is closely related with the inhibition of NKA activity. It is speculated that NKA activation can inhibit the elevated levels of intracellular Ca2 + and delay the progress of heart failure . Combined with our previous work and other scholars’, klotho protein is an essential factor required for the NKA-mediated modulation of intracellular Ca2 + level, but the specific mechanism has not yet been elucidated. We hypothesized that klotho protein can bind directly to NKA isoform, affecting the cation transporters, such as the NCX and LTCC, ultimately reduce the Ca2 +-mediated Hypertrophic signaling pathways. The group intends to establish a mouse model of heart failure and regulate the klotho protein expression by lentivirus vectors. This study is aimed to observe t the presence of NKA in the plasma membrane [Ca2+]i ,the expression of NCX,NHE, the activation of CaM–calcineurin–NFAT（nuclear factor of activated T-cells）signal pathway and the ratio of HW/BW. Mouse cardiomyocyte were cultured. By using adenovirus transfection, flow cytometry, confocal laser technology and immune coprecipitation, we will try to demonstrate that klotho protein protect against pathological stimulus -induced myocyte hypertrophy by NKA activating in vivo and in vitro, providing a new therapy target for the prevention of heart failure.

心肌细胞肥大是心力衰竭的始动环节。心肌细胞Ca2+内流增加是心肌细胞肥大的主要机制，而Ca2+内流增加与钠钾ATP酶（NKA）活性抑制密切相关。结合我们的前期工作及其他学者的研究发现，klotho蛋白是NKA调节细胞Ca2+水平必要的关键因子，但其具体机制未明。我们推测klotho蛋白可以和NKA亚基结合，影响阳离子转运体如钠钙转运体（NCX），L型钙通道（LTCC）的活性，降低Ca2+内流，抑制Ca2+依赖性肥大信号通路。本小组在构建心衰小鼠模型的基础上，通过慢病毒载体上调或者干扰klotho蛋白表达，观察心肌细胞膜中Ca2+水平、NXC、LTCC活性、钙调蛋白/钙调磷酸酶/T细胞核因子信号通路的激活情况；体外培养小鼠心肌细胞，采用腺病毒转染、流式细胞术等现代实验方法，体内、体外水平明确klotho蛋白调节NKA活性拮抗Ca2+内流介导的心肌细胞肥大，为防治心衰发病探索新的药物靶点。

心肌细胞肥大是心力衰竭发病的始动环节，与患者发病率和死亡率密切相关。钙超载是心肌细胞肥大的主要危险因素，已经发现 Na + / K + -ATPase（NKA）不仅可以调节细胞内 Na +水平，而且可以通过 Na + / Ca2 +转换体（NCX）调节细胞内 Ca2 +（[Ca2 +] i）水平。最近的研究报道认为，Klotho蛋白参与[Ca2 +] i 水平的调节。在本研究中，我们旨在探索重组klotho蛋白在改善异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大反应中的作用及其可能的机制。实验将细胞随机分为不同的处理组组。使用 Klotho蛋白、NKAα2干扰或过表达质粒、腺病毒或通道蛋白抑制剂来处理并测定异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大反应。我们的研究结果表明，与对照组相比，给予异丙肾上腺素的心肌细胞呈现较高水平的[Ca2 +] i 和肥大基因及蛋白的表达。而用 klotho蛋白处理后，对照组和 ISO组 NKAα2 的表达均升高，同时，NKA 活性升高，治疗后 NCX 活性降低。klothp 蛋白处理后同时伴随ISO组中[Ca2 +] i 水平和肥厚基因表达均降低。然而，这些作用通过 干扰NKAα2的表达能被抑制。进一步研究发现，klotho蛋白的保护作用可能与调节NCX和LTCC有关。总之，这些研究结果表明， klotho 通过激活 NKA活性并抑制 NCX 的反向模式的活性，抑制异丙肾上腺素诱导的肥厚反应，这种作用可能与 NKAα2 表达的上调有关，从而为心衰的防治提供理论依据和方向。