马铃薯卷叶病毒属病毒P0蛋白抑制局部和系统PTGS的关键序列定位和分子机理研究

目前对马铃薯卷叶病毒属病毒P0蛋白作为抑制子抑制转录后基因沉默（PTGS）及其作用方式的研究是国际上一个研究热点。本项目针对马铃薯卷叶病毒属病毒在我国和世界农业生产中的重要性和研究现状，有必要在国内外现有研究基础上，以甜瓜蚜传黄化病毒（MABYV）和甘蔗黄叶病毒（SCYLV）为主要研究材料，采取基础生物学测定和分子生物学分析有机结合，进一步定位P0蛋白抑制局部PTGS和系统PTGS的关键氨基酸序列，解析影响抑制子产生坏死症状的关键氨基酸，通过系统分析在分子水平上明确P0蛋白抑制局部沉默和系统沉默的分子作用机制。所获研究结果不仅可以在理论上为阐明马铃薯卷叶病毒属病毒P0抑制局部基因沉默和系统基因沉默的作用方式提供新的理论依据，还可以为进一步探寻通过干扰P0蛋白功能来有效控治此类病毒病害的严重危害提供理论指导和研究材料。

马铃薯卷叶病毒属病毒在世界范围内发生分布，侵染很多具有经济重要性的作物，引起严重病害。在国内外已有研究工作基础上，本项目取得以下主要研究成果：1）明确了影响MABYV P0抑制子活性的关键212位色氨酸的环状结构对抑制子功能的影响显著，并影响病毒的侵染性。通过对MABYV P0（P0MA）的保守氨基酸序列突变证明P0氨基端第12位和30位苯丙氨酸，F-box的核心区域LP(55-56)和羧基端的211位苯丙氨酸和212位色氨酸均对P0MA抑制子功能起到重要作用。用R基团为脂肪族残基的精氨酸等氨基酸以及无侧链的甘氨酸替换212位色氨酸时，P0MA失去沉默抑制子活性。而用苯丙氨酸、酪氨酸和组氨酸等环状结构氨基酸替换时，P0MA仍然可以保持沉默抑制子的作用。所有具有抑制子功能的P0突变体均能与NbSKP1互作。在酵母双杂交系统中，以P0MA为诱饵蛋白与西瓜cDNA 文库互作，得到的互作蛋白多数为ASK2 的同源蛋白。利用MABYV侵染性cDNA克隆初步表明P0的W212R突变体不能系统侵染本生烟。2）甘蔗黄叶病毒中国分离物（ScYLV-CN）P0Sc具有抑制单链和双链DsGFP-PTGS的功能，也能引起本生烟叶片注射部位坏死。利用酵母双杂交和双分子荧光（BiFC）技术确认该P0可与SKP1互作。确定P0 N端10-14位的GIKFR区和Leu85-Pro86组合对P0Sc的三种生物学活性和P0-SKP1互作都非常关键。确定P0Sc C端237-243位的EKIIFIH区和其后的SNLV寡肽对抑制DsGFP-PTGS、引起叶片坏死、P0-SKP1互作均很关键，而对其抑制SmGFP-PTGS的功能影响不大。3）鉴定马铃薯卷叶病毒内蒙分离物（PLRV-IM）P0蛋白存在4个影响抑制子活性关键氨基酸基序（L76P77-P90、W87G88、G139W140G141和F220/R）。利用myc- AtAGO1 和野生型P0PL-IM和代表性突变体分别共接种瞬时表达实验结果表明，有抑制子活性的野生型和突变体均可导致AtAGO1积累量显著降低。另外，酵母双杂交和BiFC结果初步表明P0PL-IM不能与NbSKP1和AGO1直接互作，说明P0蛋白介导抑制基因沉默的路径存在复杂性。4）对影响BrYV-A P0 （P0BrA）RNA沉默抑制和引起本生烟坏死反应的关键氨基酸扫描鉴定和分子作用机