壳聚糖介导CrmA基因转染对骨关节炎软骨退变的作用研究

白细胞介素1β(IL-1β)是骨关节炎关节软骨破坏最直接的细胞因子。细胞因子反应调节蛋白A(CrmA)可以阻断IL-1β转化酶（ICE）对IL-1β前体的剪切，抑制IL-1β的分泌。我们的前期研究显示壳聚糖可以抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡，维持IL-1β诱导下软骨细胞的增殖能力和表型,抑制骨关节炎软骨细胞基质金属蛋白酶的表达；壳聚糖复合支架与软骨细胞之间有良好的组织相容性。本项目拟构建携带CrmA基因的质粒，以壳聚糖为介导，检测转染目的基因软骨细胞的CrmA蛋白表达及功能，探讨CrmA对IL-1β的抑制作用，并研究其对骨关节炎软骨细胞的保护作用和分子机制；制作壳聚糖CrmA基因质粒微粒，探讨关节腔注射该微粒对骨关节炎软骨退变的作用，为今后以IL-1β为靶向的骨关节炎疾病的临床治疗提供理论依据。

本项目探讨壳聚糖（CS）- 细胞因子反应调节蛋白A（CrmA）纳米粒对骨关节炎（OA）软骨退变的作用。为此，进行了以下研究：（1）CrmA重组质粒的构建；（2）CS-pCDNA3.1(+)CrmA对白细胞介素1β(IL-1β)诱导的软骨细胞的影响；（3）关节腔注射CS-pCrmA纳米粒对OA软骨退变的作用；（4）此外，我们增加了壳聚糖薄膜对间充质干细胞（MSCs）的作用研究；开发了一种以TPGS-b-(PCL-ran-PGA)为载体的纳米粒。结果发现：（1）CS是一种无毒有效的非病毒基因载体，能够介导CrmA在软骨细胞中表达。CS-pDNA纳米粒无细胞毒性。（2）CS介导的CrmA能明显抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡，显著抑制软骨细胞基质金属蛋白酶（MMPs）、IL-1β转化酶（ICE）、IL-1β和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达，并显著抑制软骨细胞NF-κB报告基因的活性，但对基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIMPs）的表达无明显影响。（3）CS-pCDNA3.1(+)CrmA能显著上调IL-1β诱导的软骨细胞aggrecan和Ⅱ型胶原的表达，抑制Ⅰ型胶原、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，减少软骨细胞一氧化氮的合成。（4）关节腔注射CS-pCrmA纳米粒能够明显减轻OA软骨退变程度，显著抑制OA软骨组织MMPs、ICE、IL-1β和iNOS的表达,并上调aggrecan和Ⅱ型胶原的表达，显示CS-pCrmA纳米粒对早期OA软骨具有修复保护作用。（5）与常规贴壁培养的MSCs相比，CS薄膜培养的MSCs的形态发生了明显改变，其迁徙、干性相关基因的mRNA表达水平明显增高，显示CS薄膜培养的MSCs在维持其干性、归巢能力等方面明显优于常规培养的MSCs。（6）修饰的TPGS-b-(PCL-ran-PGA)可以作为多功能载体负载药物和基因，制备成纳米粒用于临床治疗，为进一步探讨OA的靶向治疗奠定基础。结论：CS-pCrmA纳米粒能够明显减轻OA软骨退变程度，对早期OA软骨具有修复保护作用，其机制与CrmA能通过抑制软骨细胞ICE的活性，抑制IL-1β的合成有关，本研究为OA靶向治疗开拓了新的思路。