柱状凝胶色谱与质谱联用技术研究及其在金属蛋白分析中的应用

Compared to liquid chromatography and capillary electrophoresis gel electrophoresis (GE) can be used for separating thousands of protein molecules simultaneously with the advantages of a wide range of selected separation conditions and high separation resolution which, in turn, make GE become one of the most important analytical methods or proteomics research approaches. The structural characteristics of the column gel electrophoresis (continuous flow gel electrophoresis) instrument make it more suitable and easier to be coupled with following mass spectrometers on-line than slab gel electrophoresis. In the project we are going to establish on-line hyphenated systems by coupling column gel electrophoresis with inductively coupled plasma mass spectrometry and electrospray ionization tandem mass spectrometry and apply these coupled systems for separating and identifying various metal-binding proteins and different protein expression signatures in model cells, bacteria and wistar cells after exposing to different metals. We try to locate the binding sites between metals and proteins and identify the types and functions of metal-binding proteins by bioinformatic approach in order to understand the dynamic equilibrium process of the absorption, transportation, storage and metal ion insertion at molecular level. We also want to study the structure, post modification, function and pathway of metal-binding proteins in order to elucidate the binding sites and functional mechanism of metals.

与液相色谱和毛细管电泳分离技术相比，凝胶电泳(GE)具有分离条件选择范围广、分离度高的优点，可同时分离上千种蛋白质分子，从而成为蛋白质组学研究的重要分析方法之一。而柱状凝胶电泳仪器的结构特点，使其与平板凝胶电泳和垂直凝胶电泳相比，更容易与后续质谱检测器进行在线联用。本项目拟结合柱状凝胶电泳和电感耦合等离子体质谱以及电喷雾串联质谱的优点，建立GE-ICP-MS 和GE-ESI-MS-MS在线联用系统，用于分离分析经不同金属暴露后模型细胞、细菌和wistar大鼠组织细胞中的金属结合蛋白和表达差异蛋白，并运用生物信息学技术，对金属与生物分子的结合位点及金属结合蛋白的种类和功能进行生物信息学分析，从而从分子水平上阐述金属进入生物体后吸收、转运、存储和金属离子插入等动态平衡过程，研究金属结合蛋白的表达以及表达后的修饰，并通过分析金属及相应蛋白的结构、功能及作用途径，确定金属作用位点，阐明其作用机制。

凝胶电泳(GE)因其分离条件选择范围广、可同时分离上千种蛋白质分子的特点，是蛋白质组学研究的重要分析方法之一。本项目结合柱状凝胶电泳易与后续质谱检测器进行在线联用的优点，建立了柱状凝胶电泳-电感耦合等离子体质谱（GE-ICP-MS）联用系统，并用于生物样品中金属结合蛋白的分析。.项目首先对柱状凝胶分离系统的凝胶柱径、凝胶浓度、分离电压以及洗脱部件进行了优化。将凝胶分离洗脱液经样品管直接导入ICP-MS雾化器，实现了GE-ICP-MS在线联用，可用于金属蛋白的分离测定。.本项目从蛋白质组学的角度研究了银离子、纳米银对细菌的杀菌作用机理，利用GE-ICP-MS联用技术对暴露后的铜绿假单胞菌所含的银结合蛋白进行分析，成功鉴定出多个银调节蛋白和银结合蛋白，通过生物信息学分析表明，AgNPs的抗菌活性是由于释放溶解的银离子的协同作用和颗粒特异性作用所致。项目初步探究了一种高铅耐受沙雷氏细菌对铅的吸附机制，我们从该细菌中提取的蛋白中检测到两种铅结合蛋白，将这两种铅结合蛋白的基因序列修饰后重组质粒并分别转质到大肠杆菌中，然后通过加入诱导剂IPTG诱导这两种蛋白的表达，获得了BL-P和BL-F两种转质细菌。铅暴露实验证实了转质后的大肠杆菌对Pb2+表现出高耐受性。本项目还建立了血浆和红细胞中低丰度金属结合蛋白的分析方法，利用试剂盒除去高丰度蛋白，再利用GE-ICP-MS联用技术分析大鼠和人体血浆和红细胞中的金属结合蛋白，成功检测出了汞结合蛋白、Ag结合蛋白、Cd结合蛋白和Bi结合蛋白等多种金属蛋白，并对其结构进行了鉴定。.本项目建立了离子交换色谱-柱状凝胶电泳-电感耦合等离子体质谱联用技术分离检测金属蛋白的方法，实现了复杂基质中小分子化合物和金属蛋白的分离与检测。.此外，项目还利用3D打印技术对GE-ICP-MS联用系统进行了全面的优化和改进，使用3D打印制造了包括凝胶电泳槽、洗脱装置、凝胶管在内的大部分电泳部件，实验证明该系统在优化后具有更好的性能。利用3D打印技术打印设备部件成本低，易于推广。