采用逆代谢工程策略的抗生素高产菌株分子育种研究

研究拟采用逆代谢工程策略，通过抗生素高产相关基因的筛选、功能分析确定决定抗生素高产表型的关键基因，结合相关筛选方法对这些关键基因等进行定向进化，实现抗生素产生菌的定向育种，以期高效提升抗生素产量。拟在前期大量研究的基础上，构建普那霉素产生菌的基因组DNA文库，从中获取前期工作所筛选出的普那霉素高产相关基因的全长DNA序列，并进行全面的基因结构和功能分析，明晰基因对表型的主控关系，确定决定普那霉素产量增加的关键基因；最后定向进化目标高产关键基因对始旋链霉菌进行遗传改造进而提高普那霉素产量。通过本项目研究，将明晰普那霉素高产的分子机理，建立将逆代谢工程策略和定向进化相结合的抗生素高产菌株分子育种新体系，为抗生素高产菌株的选育提供新的理论和技术支持，从而快速、高效地筛选出具有产业化价值的高产菌株。研究对提高微生物代谢产物的发酵水平、促进工业生物技术的快速发展具有重要的科学意义和广阔的应用前景。

本项目采用逆代谢工程研究策略对始旋链霉菌进行普那霉素高产相关基因的挖掘、功能分析、DNA改组和发酵工艺等研究。通过构建旋链霉菌基因组DNA文库筛选出5个普那霉素生物合成相关的新基因，进一步基因功能研究发现，编码丝/苏氨酸蛋白激酶的spy1基因可差异调控普那霉素两种组分的生物合成，其余四个基因与普那霉素生物合成呈正相关。对普那霉素高产菌株spy1基因的生物信息学分析发现其核酸序列发生突变，酶催化亚基3处二级结构域发生改变，初步阐明基因调控普那霉素高产机理。利用基因转录丰度筛选出了3个普那霉素高产关键基因；对高产关键基因ptr进行DNA改组研究，筛选获得一株普那霉素高产菌株sps16，其产量为0.12 g/L，为出发菌株的6倍；进一步序列分析表明，ptr改组基因主要发生了点突变，其中C端突变增加了螺旋的数量，初步了解了DNA改组菌株高产的分子机理。研究了培养基关键组分对普那霉素生物合成的调控机理，发现高浓度的葡萄糖、磷酸盐及铵离子可抑制普那霉素的合成。最后利用普那霉素高产菌株进行了普那霉素发酵工艺研究，发现添加乳化的正十六烷氧载体，普那霉素产量可达0.18g/L，提高了3.1倍；还发现添加甘氨酸前体并耦合树脂进行原位分离，普那霉素的最高产量可达到0.62 g/L，为对照的4.3倍。