动力蛋白驱动的纺锤体定位在细胞周期中的调控

Spindle orientation is crucial for asymmetric cell division and plays a pivotal role in the development of both animals and plants. Proper spindle orientation requires the pulling forces generated by the microtubule-associated motor protein cytoplasmic dynein. Proteins involved in spindle orientation have been identified, and their functions have been unraveled. However, it is not clear how the activity of these proteins is regulated during the cell cycle. The objective of this application is to determine, by using the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, how the activity of the dynein receptor protein Num1 is regulated by protein phosphorylation. Num1 localizes to the cell membrane, whereby it anchors dynein for spindle orientation. Our analyses have demonstrated that the C-terminal sequence of Num1 might be phosphorylated. We will use a combination of multiple approaches, including cell biology, genetics, and protein biochemistry, to dissect the functional regulation of Num1 by protein phosphorylation. On the basis of the connections between spindle orientation and tumorigenesis, this work will provide molecular insights into cancer development and progression.

纺锤体定位对于非对称性细胞分裂极其关键，在动植物的发育中起着非常重要的作用。正确的纺锤体定位需要与微管相连的细胞质动力蛋白产生的拉力。在纺锤体定位过程中起作用的蛋白及它们的功能已被揭示。但是，这些蛋白的活性在细胞周期中所受的调节还不清楚。本申请将用芽殖酵母研究蛋白磷酸化对动力蛋白的受体蛋白Num1 的活性调节。Num1 定位于细胞膜，在细胞膜上固定动力蛋白，便于其定位纺锤体。我们的分析结果表明Num1 C 末端可能被磷酸化。在本项目中，我们将综合利用细胞生物学、遗传和生物化学等手段，解析磷酸化对Num1功能的调节。基于纺锤体定位与癌症的相关性，研究将有助于理解癌症发生与发展的分子机理。

本项目执行时间为一年，重点研究了位于Num1序列C末端的磷酸化及该磷酸化对 Num1的功能及纺锤体定位的调节。我们通过原计划的9个环节的研究，成功地通过离体和体内的实验证实了位于Num1 C末端的磷酸化，并确定蛋白激酶Pkc1为负责磷酸化的蛋白激酶。同时，利用离体磷酸化实验结合点突变筛选法，鉴定出被Pkc1磷酸化的氨基酸残基，即S2719，S2730和S2733。. 为了阐明Num1的磷酸化在纺锤体定位过程中的生理学功能，我们在NUM1的染色体位点上构建了消除磷酸化和模拟磷酸化点突变体。我们发现，消除Pkc1的磷酸化导致纺锤体从母细胞转移到子细胞的几率和速率均下降，而模拟Pkc1的磷酸化则使纺锤体的移动速率增大。此外，在常规的细胞分裂中，不能被磷酸化的点突变体也显示了与动力蛋白功能相关的缺陷，包括纺锤体定位异常及细胞核转移失败，并因此导致双核细胞的产生。 这些研究结果表明，Pkc1对Num1的磷酸化对于纺锤体定位有正面的调节作用。. 在芽殖酵母的有丝分裂中，纺锤体和细胞核从母细胞到子细胞的定向转移需要动力蛋白Dynein。但是，与Num1同时存在于母细胞膜和子细胞膜上的Dynein如何定向地朝子细胞产生拉力是一个未解的问题。本项目的研究结果表明，Pkc1对Num1的磷酸化可能是差异性地调节母子细胞膜上的Num1和Dynein功能的机制 ：即Pkc1在母细胞膜上特异性地磷酸化Num1，此磷酸化抑制Num1与Dynein的相互作用，一方面阻止Dynein分子在Num1位点过多地积聚，另一方面减弱Dynein在细胞膜上的固定，从而抑制其功能。而子细胞膜上的Num1未被Pkc1磷酸化，可以正常锚定Dynein，有利于其产生拉力来移动纺锤体。 这些研究结果阐明了Num1的磷酸化对Num1和Dynein功能的时空调节。由于纺锤体定位的调节机制在真核生物中是保守的，本项目在酵母中取得的研究结果将对别的类型的细胞的研究具有借鉴意义。同时，因为异常产生的多倍体细胞可以诱导癌细胞的产生，本研究对于揭示多细胞生物中癌症的分子机制也具有指导作用。