反硝化细菌的鉴定及其与胆固醇降解相关蛋白、基因的初探

The studies of cholesterol degradation under denitrifying condition are still at a nascent stage. However, only one genus, Sterolibacterium, was isolated and taxonomic identified. In resent, we isolated two new denitrifying strains which can grown on cholesterol as sole carbon and energy source anaerobically. The 16s rDNA sequences of the two strains were 94% identity to that of Sterolibacterium. In this project, the two strains will be taxonomically classified, first. And the proteins in cholesterol grown cells will be in comparison analyzed with other substrates grown cells through 2D-Gel. And the specific traces will be sequenced with TOP-MASS or N-terminal sequencing. The operons and genes specific for cholesterol degradation will be identified with RNAseq, Sanger and/or Pyrosequencing.

胆固醇作为自然界中最常见的固醇类化合物，关于其在反硝化条件下降解代谢过程的研究尚刚起步。目前仅发现Sterolibacterium属的细菌具有代谢活性。本课题组近日从土壤样品中分离到两株能够以硝酸盐为电子受体降解胆固醇的细菌，它们的16s rDNA的序列与Sterolibacterium属的相似度为94%。本项目将利用最佳培养温度、pH、多底物代谢能力、氧化酶活性、触酶活性、全基因组测序、拍摄扫描电镜照片、化学分析等技术手段从细菌生理、生化、细菌形态、细胞化学成分构成以及遗传物质相似性等方面对该细菌进行系统分类鉴定；同时将采用双向电泳结合串联质谱、高通量转录组测序和DNA杂交等方法获得降解胆固醇的相关蛋白序列及基因编码。本研究将为今后从事反硝化条件下胆固醇降解代谢研究提供新的模式菌株，并且为深入阐明降解途径及中间代谢产物提供相关酶的氨基酸序列及基因编码等信息。

动物可以合成胆固醇却没有降解代谢胆固醇的能力，而肠道微生物具有降解和转化胆固醇的能力。本项目研究了胆固醇富集物中的菌群结构，分离得到了几个与胆固醇降解代谢相关的菌株。此外实验中观察了高胆固醇饲料可以增加高血脂症模型动物肠道中金黄色葡萄球菌的丰度，同时天然药物提取物PGF对这一改变有改善作用，因此探讨了该部位对金黄色葡萄球菌的抑制和杀伤活性。并对PGF的其他生物活性进行了初步探索。具体研究结果及成果如下：.1．肠道菌群中与胆固醇降解有关的细菌的分离、鉴定以及胞外多糖结构构成的研究.从chol-01富集物中分离到细菌Paeni B69，该细菌胞外多糖结构与构成有利于细菌与底物结合和运输，通过分子生物学和化学的研究方法揭示该多糖为5个单糖构成的重复片段，揭示了参与该片段合成的葡萄糖苷转移酶的基因编码。还发现肠道中金黄色葡萄球菌的丰度受食物中胆固醇含量的影响。.2. PGF部位抑制金黄色葡萄球菌活性部位的研究. 赶黄草茎活性部位（PGF）以及其中的三个乔松素葡萄糖苷衍生物（S1、S2和S3）对临床耐药型金黄色葡萄球菌的增值有抑制作用。根据MBC/MIC比值我们判断PGF和衍生物S3有杀菌活性，并对该活性进行了深入研究。而衍生物S1和S2仅有抑菌活性，但在这两个化合物的联合作用下S3的抑菌活性显著增强。.3. PGF部位化合物的分离与鉴定.赶黄草茎、叶活性部位中的三个乔松素葡萄糖苷化合物经HPLC-MS/MS鉴定分别为，乔松素-7-O-[4‘,6’-(S)-六羟基联苯二酰基]-β-D-葡萄糖苷（S1），乔松素-7-O-[3‘-O-没食子酰基-4’,6‘-(S)-六羟基联苯二酰基]-β-D-葡萄糖苷（S2），乔松素二氢查耳酮-7-O-[3‘-O- 没食子酰基-4’,6‘- 六羟基联苯二甲酰基]-β-D- 葡萄糖苷（S3）。.4. 活性验证. 赶黄草茎、叶活性部位在高浓度下均有细胞毒性，在非细胞毒性浓度下均有抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌以及金黄色葡萄球菌等常见肠道机会致病菌增殖的活性；清除自由基的活性；保护细胞氧化氧化损伤的活性；保护细胞脂质过氧化损伤的活性和防止细胞脂脂蓄积的活性。且茎、叶两个部位的生物活性没有显著性差异。..发表论文情况.已发表核心期刊论文1篇，SCI论文3篇。1篇文章已经被ESCI期刊收录，将于今年下半年见刊。