USP39调控VEGF-A可变剪切促进晚期肾癌舒尼替尼耐药的作用及机制研究

The development of sunitinib resistance in renal cell cancer predicts a poor outcome for renal cell cancer patients, and is currently incurable. The underlying mechanism of sunitinib resistance is still unclear. In the preliminary study, the expression of RNA cleavage-related protein USP39 was significantly higher in sunitinib-resistant renal cell carcinoma. The sunitinib-resistant cell line silenced USP39 can restore the drug-sensitivity to sunitinib. Meanwhile, USP39 regulates alternative-splicing of VEGF-A by interacting directly with SRSF1 and SRPK1. And alternative-splicing of VEGF-A through the autocrine pathway is an important cause of sunitinib resistance, suggesting that USP39 may promote sunitinib resistance in renal cell cancer by alternative-splicing of VEGF-A regulation. To demonstrate this hypothesis, our study is intended to clarify the relevance of USP39 to sunitinib resistance from a large number of tissue samples; study on molecular mechanism of USP39 regulating sunitinib resistance by alternative-splicing of VEGF-A from molecular and cellular levels; the feasibility of USP39 as a diagnostic and therapeutic target was explored from animal experiments, in order to provide theoretical basis and molecular target for the early diagnosis, drug guidance and treatment of sunitinib resistance.

晚期转移性肾癌的舒尼替尼耐药是临床面临的治疗难点，且目前对这一机制研究尚缺乏突破性的进展。项目组前期研究中发现，RNA剪切功能相关蛋白USP39在舒尼替尼耐药肾癌组织和细胞中表达显著升高，在舒尼替尼耐药细胞株中敲减USP39能恢复耐药株对舒尼替尼敏感性，同时USP39通过直接与SRSF1和SRPK1相互作用调控VEGF-A可变剪切体形成，而VEGF-A可变剪切体通过自分泌通路是导致舒尼替尼耐药的重要原因。从而提示USP39可能通过调控VEGF-A可变剪切促进晚期肾癌舒尼替尼耐药发生。为证明这个假说，本申请拟从大量组织标本明确USP39与舒尼替尼耐药的相关性；从分子及细胞水平研究USP39通过VEGF-A可变剪切调控舒尼替尼耐药的分子机制；最后通过动物实验探讨USP39作为诊断和治疗靶标的可行性，以期为舒尼替尼耐药的早期诊断、用药指导和治疗提供理论依据和分子靶标。

肾癌是泌尿系统最常见恶性肿瘤之一，发病率逐年上升。肾癌对传统的放化疗和免疫治疗均不敏感，靶向治疗是晚期肾癌的一线治疗方案。肾癌靶向药物（贝伐珠单抗、舒尼替尼、培唑帕尼等）主要针对肿瘤分泌的VEGF-A和肿瘤血管内皮上的VEGF-A受体（VEGFR）。因此深入理解VEGF-A的形成和作用是揭秘肾癌恶性进展及其靶向耐药的关键所在。本项目通过Oncomine基因数据库分析发现USP39在肾癌中表达水平显著高于正常肾组织，高表达USP39显著预示不良生存预后，尤其在肾肿瘤TNM分期的Ⅰ~Ⅱ期和Fuhrman病理等级1~2级患者中。USP39表达水平是肾癌肾癌生存预后的独立危险因素，联合TNM分期，构建了更为敏感、精确的肾癌预测模型。细胞功能实验发现，肾癌细胞中敲减USP39后，显著抑制肾癌细胞恶性增殖、克隆形成，同时细胞周期S期阻滞。通过免疫共沉淀联合串联质谱分析，USP39相互作用于SRSF1和SRPK1，USP39表达水平通过影响SRPK1与SRSF1的相互作用，干扰SRPK1磷酸化SRSF1，导致VEGFA的可变剪切体表达水平发生变化，进而诱导肾癌恶性进展和血管形成。同时课题组通过miRDB和miRTarBase两大microRNA数据库筛选、肾癌组织细胞验证发现miR-497-5p作用于PD-L1的3´-UTR，调控肿瘤细胞PD-L1表达水平。细胞功能实验发现肾癌细胞抑制miR-497-5p表达水平显著提高肾癌细胞的恶性增殖、克隆形成等细胞功能，miR-497-5p低表达水平的肾癌患者具有较差的生存预后。以上研究结果对于进一步肾癌发生、发展提供了新的思路，同时为进一步早期诊断、复发\转移\生存精准预测提供了新的理论指导，具有重要的科学意义。本项目资助下，以第一或者共一作者发表SCI论文6篇，总影响因子38.342；协助培养硕士研究生3名，完成肾癌相关毕业论文3项。