用γ射线羟基自由基标记、质谱和分子对接等技术联合解析蛋白质复合物结构新技术的研究

The structure elucidation of protein-protein complex is the key network in elucidating the processes such as cellular metabolism, signal transduction and gene expression, and plays a significant role in the environmental pollution and health research. In this project, we utilize the γ-ray exposure to achieve the oxidation labeling of the solvent accessible side-chain of protein and protein-protein complexes, and then combine enzyme digestion technology, LC-MS and molecular docking method to establish the reliable and novel strategy in the structural assessment of protein-protein complex. We will solve the problems of the continue oxidation in solution after stopped radiation, and provide a new method to assess the structure of trace (fmol-pmol) complex under physiological conditions. This method will be put into use for analyze the undiscovered structures of 3-5 protein complex including p85ni:iSH2 and TcP1beta:TcP2alpha et.al, and extend the range of γ-ray application, which will also increase our international influence in the field of protein complex assessment and biological effect of environmental pollutants evaluation on molecular level..Solving the scientific problems, we will apply for 4-6 patents, publish 12-16 papers in SCI including 7-10 papers the impact factor of which exceed 3, and train 5-6 students for master's degree, 3-5 for Ph D degree and 2-3 postdocs.

蛋白质复合物的结构解析是阐明细胞代谢、信号传导和基因表达等的关键环节，对环境污染与健康的研究具有重要意义。本研究拟通过γ射线照射，实现与溶剂水分子接触的蛋白质及复合物氨基酸侧链的氧化标记，然后联合生物酶切技术、LC-MS和分子对接技术建立解析蛋白质复合物结构可靠的新方法。解决联合解析技术中γ射线照射停止后溶液中发生继续氧化的难题；为生理条件下水溶液中微量(fmol-pmol)蛋白质复合物结构解析提供新的研究手段。利用该方法将解析p85ni:iSH2、TcP1beta:TcP2alpha等3-5个蛋白质复合物的未知结构；将拓宽γ射线的应用范围，提高我国在蛋白质复合物结构解析、分子水平上环境污染物生物学效应评价等领域研究的国际影响力。.解决上述学术问题，预计申请专利4-6项，发表SCI论文12-16篇，其中影响因子大于3的约7-10篇；培养5-6名硕士研究生、3-5名博士研究生，2-3名博士后

制作了γ射线照射装置并在山东省农科院样品辐照时使用，优化了后氧化消除的实验条件，研究了γ射线照射剂量及活性氧(H2O2)对蛋白质结构和功能的影响，明确了所研究蛋白质结构和功能的照射条件。利用γ射线照射法产生羟基自由基标记技术解析了p85ni中iSH2和nSH2的结合面。证实p85二聚体中多肽的结合部位；实现了IA型PI3-激酶p85、p85二聚体以及阻凝蛋白(myosin)的解析，以及对从铜假绿单胞菌VI型分泌系统中提取的Tse1效应蛋白和其对应的免疫蛋白Tsi1蛋白以及两者形成的Tsi1-Tse1复合物的标记。利用生物酶切技术将相应蛋白质及其复合物酶解为多肽，利用液相色谱-质谱等技术对酶解多肽进行了定性和定量研究，解析了蛋白质及其二聚体和复合物的结构。.用γ射线照射水产生羟基自由基来研究其对HSA的氧化作用机理。在体外模拟生理条件，从分子水平上研究了H2O2对胰蛋白酶的毒性作用机制，并分析了H2O2对胰蛋白酶的结构和功能影响，从而进一步完善过氧化氢的毒性评价系统。.建立了三氯杀螨醇与α-糜蛋白酶复合物的结构模型、4-氨基安替比林(AAP)：铜锌超氧化物岐化酶(SOD)复合物的结构模型，建立了揭示了其毒性作用机理；研究了两种氟喹诺酮类药物CPFX 和ENFX 对过氧化氢酶(CAT) 结构和功能的影响，建立了CPFX:CAT和ENFX:CAT蛋白质复合物的结构模型。证实了盐酸克伦特罗（CLB）与胰蛋白酶通过氢键和范德华力与CLB发生作用，对胰蛋白酶的结构和功能产生的影响。完成了甲型流感(H7N9)血凝素与禽流感型和人型受体类复合物结构的研究。本研究拓宽了质谱和光谱技术在蛋白质结构解析、毒性作用 领域的应用，达到了预期的研究目标。