小麦再生相关主效基因克隆和功能分析

植株再生是植物细胞工程育种和基因工程育种的关键步骤，而植物再生性能在基因型间差异显著，限制了细胞工程育种和基因工程育种效率。研究表明，植株再生与少数几个基因有关，亚硝酸还原酶基因(NiR)是其中的主要基因之一，通过转化培养基中的亚硝酸盐，减少对植物细胞的伤害，从而影响植株再生。普通小麦虽然也存在再生能力较好的基因型，但大多数基因型再生能力较差，关于小麦中NiR基因克隆和功能分析目前还没有报道。本项目拟利用水稻、短柄草基因组信息和小麦EST序列，从小麦胚培养再生能力不同的基因型中国春和CB037中克隆NiR基因，研究NiR基因结构、表达特性和遗传特性，分析编码蛋白的生化特性和结构。同时，在中国春中表达来自CB037的NiR基因，分析小麦中NiR基因的功能，为在小麦转化中将NiR基因作为筛选标记利用奠定基础。研究结果对于提高小麦细胞工程和基因工程育种效率及培育无筛选标记转基因小麦具有重要意义。

克隆了编码小麦亚硝酸还原酶（TaNiR）基因的cDNA（1884bp）和gDNA序列（3071bp），TaNiR包含4个外显子和3个内含子，编码蛋白大小为65.7kD，在氨基酸水平上与其它植物NiR同源性达70%以上，与水稻同源性达84%以上。结合TaNiR与Ferredoxin互作分析结果，确认所克隆的基因为编码小麦亚硝酸还原酶的TaNiR基因，且该基因gDNA序列在高、低再生能力小麦基因型中的一致性达96.91%。Southern杂交分析发现TaNiR基因在小麦基因组中存在6个拷贝。利用特异引物组合对一套四倍体小麦-粗山羊草代换系进行PCR扩增检测的结果表明，TaNiR在小麦6B、6A上各存在1个拷贝，进一步以普通小麦双端体为材料，将TaNiR基因的1个拷贝定位在6BL上。利用IPCR技术得到了TaNiR基因启动子序列，发现其在不同小麦品种存在少数SNP，不存在InDel。对TaNiR基因调控元件进行的功能分析结果表明，包含TaNiR第一个内含子区段的调控功能比其他片段强。. 在原核细胞中成功表达了TaNiR基因编码的目标蛋白，与预期大小相符。发现KNO3处理小麦幼苗1 h后TaNiR的表达量最高，随着处理时间的延长下降；但随着处理天数的延长，TaNiR活性明显上升。组织表达特性分析表明，TaNiR基因在7个小麦组织中都有表达，叶和茎中的表达量最高，小花中表达量较低，尽管胚性愈伤组织比非胚性愈伤组织具有稍高的表达趋势，但总体表达趋势较低。利用基因枪分别将TaNiR基因过表达载体和RNAi载体转化小麦获得了转基因植株，对T1代转基因植株进行的功能分析表明，TaNiR基因过表达没有明显影响小麦幼胚再生率，认为TaNiR基因可能不是小麦再生的关键基因。. 另外，发现小麦幼胚愈伤组织诱导阶段进行生长素间歇处理显著提高了植株再生率，该性状变化与过氧化氢酶（CAT）表达密切相关。进一步从小麦中克隆了TaCAT3基因及3个TaCAT基因的启动子，并对启动子序列进行了结构特性分析、进化分析和功能原件缺失分析。. 本项目完成了计划任务，达到了预期目标。共克隆了8个TaNiR基因、TaCAT基因或启动子序列，并提交GeneBank；发表了4篇SCI论文，6篇核心期刊论文；获得了1项国家专利，申请了1项国家专利；培养了1名博士研究生和3名硕士研究生