基于DNA甲基化变异的杨树种质创制基因工程技术体系构建

DNA methylation is an important phenomenon of epigenetic modification. Changes in DNA methylation might cause phenotypic traits in plant and could transfer to their progenies. Poplars are an important fast grown tree species in China and have crucial economic, social and ecological values. Up to now, studies on new germplasm production by DNA methylation modification in poplar have not been reported. In this project, using Populus nigra as material, genes for DNA methylation and demethylation cloned from Arabidopsis, under the chemical induced promoter will be transferred into the genome of poplar. Through artificial controlling the expression of exogenous genes by chemical inducer, transgenic plants with different DNA methylation level and heritable epigenetic phenotypes might be obtained, which will become valuable plant materials for epigenetic study and provide genetic resources for poplar breeding. This project is going to explore a genetic engineering system for creating DNA methylation mutants in plant.

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，DNA甲基化状态的改变可能会引起植物表型变化，并且这种表观变异可传递给后代。杨树不仅是林木基因工程的模式树种，也是我国三大速生树种之一，具有重要的经济、社会和生态作用。目前，利用DNA甲基化修饰进行种质创制在国内外杨树育种中尚未开展。本项目以具有重要生产和育种价值的欧洲黑杨为材料，采用转基因方法，将诱导启动子下的拟南芥DNA甲基化及去甲基化关键基因转入杨树中，通过化学诱导剂控制外源基因的表达，获得具有不同甲基化水平的转基因植株，以创造大量的可遗传表观变异，为表观遗传研究提供材料，同时丰富杨树育种资源，探索出一个人工创造植物甲基化变异，扩大植物遗传变异的基因工程技术体系。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，DNA甲基化状态的改变可能会引起植物表型变。人为改变植物的基因组甲基化，能够创造可遗传的表观遗传变异。杨树是我国三大速生树种之一，具有重要的经济、社会和生态作用。同时，杨树也是林木基因工程的模式树种。本项目以白杨派优良品种84K杨（Populus alba × P. glandulosa ‘84K’）为试验材料，采用农杆菌介导法将化学诱导启动子及其调控下的拟南芥甲基化/去甲基化关键基因——甲基转移酶基因AtMET1、转葡糖基酶基因AtDME分别导入84K杨基因组中，经PCR、DNA测序等方法检测，获得了18个转AtMET1的84K杨株系和6个转AtDME的84K杨株系。通过化学诱导剂17-β-雌二醇对随机挑选的1个转AtMET1株系和1个转AtDME株系的离体叶片进行化学诱导处理，qRT-PCR结果显示， 17-β-雌二醇能迅速有效地调控转基因杨树中AtMET1和AtDME 的表达。采用雌二醇处理0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、96 h、144 h的叶盘，分化芽生根培养后，转AtMET1株系获得诱导再生植株88株，转AtDME株系获得诱导再生植株141株。生理生化指标测定结果表明，转AtMET1 植株叶片处理后再生植株与非转基因对照相比，12 h处理株系2的苗高极显著低于对照；3个处理均有株系的叶长宽比、Pn、Gs以及可溶性蛋白含量极显著低于对照；12、24 h处理有株系的Ci显著低于对照，可溶性糖含量显著高于对照；而3 h处理株系2的Tr极显著低于对照，WUE极显著高于对照，处理3、12 h有株系的POD酶活性显著高于对照，其他差异均不显著。转AtDME植株叶片诱导表达再生植株与非转基因对照及转AtDME诱导0 h植株相比，3个处理都有株系的叶长宽比、Gs、Ci、Tr以及可溶性蛋白含量极显著低于对照，相对叶绿素含量、WUE和保护酶活性显著高于对照；处理3、12 h有株系的Pn极显著高于对照，处理3、24 h均有株系的可溶性糖含量极显著高于对照，其他差异不显著。该项目建立了一种通过基因工程手段调控杨树基因组甲基化状态，从而创制杨树新种质的技术体系，该体系对林木种质创新、选育高产优质高抗的新品种具有重要意义。