柑橘不同抗性品种被黄龙病菌侵染后体内转录组变化的比较分析

柑橘黄龙病是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害，也是我国包括江西柑橘产区在内的最重要的病害之一。近年来,国内外对柑橘黄龙病进行了大量的病原检测鉴定和遗传变异性研究，但涉及黄龙病发生机理的研究很少。在项目前期开展柑橘不同品种田间调查和室内抗性鉴定而获得高抗、中抗和高感品种的基础上，本申请拟采用目前基因表达研究中广泛使用和具有独特优势的高通量基因芯片表达技术，开展不同抗性柑橘品种被黄龙病菌侵染后体内转录组变化的比较分析，通过比较分析，将发现与特定抗感反应相连的、其转录水平发生显著变化的基因，这些基因将被定义为决定各自抗感表型的抗病或感病基因。本项目的完成将从转录水平上为不同抗性柑橘品种对黄龙病的抗性差异提出一个合理的解释，同时，对阐明柑橘抗黄龙病的分子机制，指导柑橘黄龙病抗性的合理利用和品种抗性的遗传改良具有重要的理论意义和实践价值。

柑橘黄龙病 (Huanglongbing, HLB)主要由亚洲韧皮部杆菌(Candidatus liberibacter asiaticus, CLas)引起，是国内外柑橘生产上最具毁灭性的病害。柑橘对黄龙病抗性的分子机理研究是黄龙病研究的前沿领域，通过对其分子机理的解析，有望给柑橘黄龙病防治提供新思路。本项目应用基因芯片技术检测不同抗性柑橘品种在接种黄龙病菌后的基因差异表达情况，通过比较分析和功能解读，阐述不同柑橘品种对黄龙病具有不同抗性的内在原因。项目取得如下研究结果：.1. 柑橘黄龙病毒源树筛选。从江西省柑橘黄龙病病区采集30份可疑病叶样品，对其进行柑橘黄龙病菌、柑橘衰退病毒和植原体检测，结果从大余县曾家果园筛选到2株只含黄龙病菌，而不含衰退病毒和植原体的黄龙病菌纯一毒源树。.2. 不同柑橘品种对HLB的室内抗性鉴定。从上述HLB毒源母树上取枝条作接穗，对不同柑橘品种进行嫁接（芽接），用PCR技术定期（每月1次）检测各品种的感染情况，并观察症状表现，结果发现柑橘品种椪柑高度感染黄龙病，琯溪蜜柚对黄龙病则有较强的抗性。.3.基因差异表达分析。采用基因芯片技术，对接种黄龙病菌后3个月和6个月的椪柑和琯溪蜜柚植株叶片及其健康对照植株叶片进行基因表达检测和差异表达基因筛选，对差异基因进行Go功能和Pathway分析，结果表明，抗病品种琯溪蜜柚在两个时间点上调的GO词条数目明显多于感病品种椪柑，并且琯溪蜜柚在接种后6个月的GO词条数目相比接种后3个月明显增多。在琯溪蜜柚6月转录组的数据中，生物胁迫、免疫系统、细菌防御这些词条明显上调。通过单因素参数分析，发现在受到黄龙病菌侵染后，琯溪蜜柚在植物生长、碳水化合物代谢、苯丙烷合成、生物胁迫等方面的基因呈上调表达；而通过差异基因Pathway分析，发现在琯溪蜜柚中有关细胞壁合成、水杨酸及茉莉酸合成基因和β-1,3-葡聚糖酶、抗病相关物质、转录因子等基因呈现上调表达。与椪柑不同，琯溪蜜柚对黄龙病菌侵染作出积极反应，以此提高自身抵抗黄龙病菌侵染的能力。.4.抗病基因同源序列克隆。用抗病基因保守区域的简并引物对3个柑橘品种的抗病基因同源序列（RGAs）进行克隆并对RGAs进行序列分析，结果共获得17条RGAs，这17条RGAs均含有NBS-LRR 类抗病基因的保守域。这些RGAs的获得为克隆柑橘全长抗病基因奠定了基础。