功能宏基因组学方法表征环境样品镉抗性基因多样性

Heavy metal resistance genes are important resources for bioremediation. For example, mercury and arsenic resistance genes have been used in the genetic engineering of efficient bioremediation tools. The identification of microbial cadmium (Cd) resistance genes are mostly based on the pure culture of resistance strains currently. In this project, we aim to the screening and identification of Cd resistance genes from environmental DNA using the functional metagenomic approach. Briefly, DNA from contaminated soil, sediment and water is used for the construction of small-fragment clone library. Positive clones are screened out based on Cd stress tests and subject to sequencing. Candidate resistance genes are then amplified and subject to Cd stress tests as well for positive genes. Meanwhile, shotgun sequencing and bioinformatic assembly of the environmental DNA are carried out, which can provide genomic-context for the annotation and evolutional analysis of the positive Cd resistance genes. The outcomes of this project may expand our understanding of microbial Cd resistance mechanisms, and provide gene resources for genetic engineering of Cd bioremediation tools.

重金属抗性基因是生物修复技术的重要资源，如微生物汞和砷抗性基因已经被用于高效生物修复材料的基因工程。目前，微生物镉抗性基因的发现与表征仍依赖抗性微生物纯培养途径。本研究拟使用近几年发展的功能宏基因组学手段，从环境样品中高通量地获得和表征镉抗性基因。环境DNA提取自重金属污染土壤、底泥和污水等。使用上述环境DNA构建小片段克隆文库，然后通过功能基因组手段筛选出阳性克隆子，在此基础上切割并筛选阳性镉抗性基因。所获抗性基因进一步转入镉敏感菌株，以观测其抗性能力和体内镉富集特征。与此同时，环境DNA进行高通量测序和组装，以为功能基因组所获序列的注释和进化分析提供生物信息学支持。本研究的结果将高通量地获得有活性的镉抗性基因，这些基因将拓展已知的镉抗性机制多样性，并为高效镉污染修复材料的基因工程提供基因资源。

重金属抗性基因是生物修复技术的重要资源。传统研究策略中，微生物镉抗性基因的发现与表征仍依赖抗性微生物纯培养途径。本研究以自主发展的功能宏基因组学流程为基础，结合比较转录组学、基因组学、系统生物学等方法，从环境样品中高通量地获得和表征了大量镉抗性、铜抗性基因，并重点研究了金属硫蛋白（MT）基因和金属转运蛋白copA基因，拓展了对环境微生物重金属抗性机制的认知。主要研究结果有：（1）采集并分析环境样品7份，构建宏基因组文库4个，发展了重金属抗性基因高通量挖掘方法，鉴定了大量新颖的土壤微生物重金属抗性基因，经过生物学功能验证的新颖镉抗性基因30个、铜抗性基因19个；（2）挖掘表征了环境微生物的MT基因和copA基因的系统多样性，鉴定了数个有生物学功能的新颖MT和CopA，其中MT5可以在不影响使宿主大肠杆菌生长的前提下，使细胞内的镉富集量增加13.7倍；（3）基于采集样品和宏基因组分析结果，从土壤中分离鉴定了3株新颖重金属抗性微生物菌株（紫孢菌YZ1、纤维单胞菌Y8和芽孢杆菌T6），采用转录组、功能基因组、代谢组学和系统生物学方法表征了它们的重金属抗性，初步阐明了重金属抗性机制；（4）通过毒理学试验、比较转录组分析、基因组深度注释以及传统的功能基因组学方法相结合，对三个跨界的模式物种（大肠杆菌、酿酒酵母和莱茵衣藻）在镉胁迫下的保守调控基因和模型进行了分析，找到了保守应答途径及相关基因。四种共有调控途径与镉胁迫相关，包括ROS反应、硫代谢、细胞壁重塑以及金属离子转运，并将该保守性注释到了基因家族层次。本项目执行期内共发表研究论文11篇，授权国家发明专利5件。本项目研究不仅实现了通过功能宏基因组学手段筛选并注释环境DNA中活性重金属抗性基因，并且进一步完善了相关方法、拓展了样品多样性。相关成果不仅拓展了专业领域研究人员对环境中微生物镉抗性机制多样性的认识，同时为面向重金属生物修复的基因工程提供可观基因资源、微生物种质资源和新思路。