PD-1基因敲除的EBV TCR-T在EBV相关胃癌免疫治疗中的应用价值

EBV associated gastric carcinoma is one of the most important subtype of gastric cancer according to the latest molecular classification. It is characterized by the up-regulation of immune regulated pathway such as PD-1/PD-L1. TCR-T immunotherapy has shown its advantages in solid tumor therapy. Latent membrane protein 2 has good immunogenicity, which contains antigenic epitopes of CTL action and is an effective target of immunotherapy for EBV-associated gastric cancer. Therefore, the selection of LMP2 as a therapeutic target and the reversal of immune tolerance are expected to improve the efficacy of immunotherapy for EBV-associated gastric cancer. However, most patients with EBV-associated gastric cancer were diagnosed as middle and late stage, and the T cells from peripheral blood had low immune function and low transfection efficiency. On the basis of successful knockout of PD-1 molecules in activated T cells to reverse immune tolerance, we intend to screen EBV TCR-T and transfect the two plasmids respectively carrying integration of EBV TCR-T and PD-1 knock-out by electrotransfection mode. Using this technique, PD-1 gene knockout EBV TCR-T was prepared from T cells derived from umbilical cord blood, and in combination engineered cells for co-stimulatory enhancement optimized culture conditions. The aim of this project is to establish a new immunotherapy technique for the clinical application.

EBV相关胃癌是胃癌分子分型中的重要类型之一，PD-1/PD-L1等免疫调控通路的活化是该类型胃癌的重要特征。TCR-T技术在实体瘤治疗中已显示出优势，LMP2A具有较好的免疫原性，它包含了CTL作用的抗原表位，是EBV相关胃癌免疫治疗的有效靶点。所以选择LMP2A为靶点制备EBV TCR-T，以及逆转免疫耐受有望提高EBV相关胃癌免疫治疗疗效。但多数EBV相关胃癌患者确诊时为中晚期，外周血来源的T细胞免疫功能低且转染效率不高。在前期成功敲除活化T细胞中的PD-1分子以逆转免疫耐受的基础上，本研究拟筛选EBV TCR-T，并采用电转模式同时转染EBV TCR-T转入质粒以及PD-1敲除质粒，从脐血来源的T细胞制备PD-1基因敲除的EBV TCR-T，并联合共刺激基因工程细胞优化培养体系，在EBV表达阳性的胃癌肿瘤中进行评估，为今后的临床应用提供依据。

研究背景：.EBV相关胃癌是胃癌分子分型中的重要类型之一，PD-1/PD-L1等免疫调控通路的活化是该类型胃癌的重要特征。TCR-T技术在实体瘤治疗中已显示出优势，LMP2A具有较好的免疫原性，它包含了CTL作用的抗原表位，是EBV相关胃癌免疫治疗的有效靶点。所以选择LMP2A为靶点制备EBV TCR-T，以及逆转免疫耐受有望提高EBV相关胃癌免疫治疗疗效。但多数EBV相关胃癌患者确诊时为中晚期，外周血来源的T细胞免疫功能低且转染效率不高，所以拟采用脐血制备PD-1基因敲除的EBV-TCR-T。.研究内容：.结合TGCA数据库及文献，基于中国人常见HLA位点，设计并合成针对EBV-LMP2A抗原表位肽，体外进行LMP2A-CTL的诱导，利用流式分选四聚体以及 CD8 双阳性的抗原特异性 T 细胞，分选细胞进行测序获得TCR配对α链和β链，构建基于PiggyBac转座子的p-donor-EBV TCR质粒。体外验证EBV TCR-T的功能，从脐血来源的T细胞制备PD-1分子敲除的EBV TCR-T的细胞，在体外以及EBV阳性胃癌肿瘤中进行功能评估。.重要结果：.根据数据库及文献，成功构建12条针对EBV-LMP2A的抗原肽，体外成功诱导出EBV-CTL，并利用四聚体及流式技术成功分选出抗原肽特异性T细胞，并进行基因测序，获得TCR的基因序列；进行电转，制备EBV-TCR-T，研究发现TCR-T转染效率在3%~17%之间，EBV TCR-T的免疫应答IFN-γ分泌能力是对照组的30倍，且EBV TCR-T具有抗原特异性杀伤作用。脐血来源的T细胞在增殖及电转方面优于胃癌患者来源的T细胞，利用脐血来源的T细胞制备的PD-1基因敲除的EBV-TCR-T在体外及体内都具有更优的抗肿瘤能力。.科学意义：建立了一种新型的T细胞治疗模式，为潜在的临床应用提供理论和实验依据，并为其他类型的细胞治疗技术的改进奠定基础。