特异性lncRNA调控KLF16介导成纤维细胞增殖在病理性瘢痕形成中的机制研究

Fibroblasts proliferate excessively is the key link in the progress of pathological scar formation and it is brutish,but the mechanism is still not clear.The previous research found that histone and DNA methylation are important mechanisms of pathological scar formation,lncRNA can participate in gene regulation through epigenetics,and the preexperiment indicated that it was involved in the regulation of fibroblast proliferation.Therefore, it is speculated that the specific lncRNA mediated target gene expression through regulating histones and DNA methylation is an important mechanism for the proliferation of fibroblasts.To test this hypothesis,the specific lncRNA(Chast) in pathological scar tissue was screened and verified;constructed Chast and its functional target gene KLF16 adenovirus vector and transfected into fibroblasts,analyzed the proliferation of cells,defined the role of Chast and KLF16 in it;the strategy of blocking mainly starts from multidirectional adjustment including Chast、 histone and DNA methylation,to explore the effect on target gene when each equilibrium model is broken,revealed Chast raises epigenetic factors(EZH2 and DNMT1) to regulate histones and DNA methylation to mediate KLF16 to induce the proliferation of fibroblasts,to provide new ideas for revealing pathologic scar formation mechanism and biological therapy.

成纤维细胞过度增殖是病理性瘢痕形成的关键环节，危害性大，但机制不清。前期研究发现组蛋白和DNA甲基化是病理性瘢痕形成的重要机制，lncRNA可通过表观遗传学参与基因表达调控，且预实验提示其参与了成纤维细胞增殖的调节，故推测:特异性lncRNA通过调控组蛋白和DNA甲基化介导靶基因表达是成纤维细胞过度增殖的重要机制。为了验证该假说，筛选病理性瘢痕组织中的特异性lncRNA(Chast)并予以验证；构建Chast及其功能性靶基因KLF16腺病毒载体转染成纤维细胞，分析细胞的增殖情况，明确Chast和KLF16在其中的作用；采用阻断为主的策略从Chast及组蛋白和DNA甲基化等多向调控入手，探讨各自平衡模式被打破后对靶基因的影响，揭示Chast募集表观遗传学因子(EZH2和DNMT1)调控组蛋白及DNA甲基化介导KLF16引起成纤维细胞增殖的作用，为揭示病理性瘢痕形成机制和生物学治疗提供新思路。

背景：病理性瘢痕(Pathological scars，Ps)是人体皮肤受到创伤后真皮组织过度修复所特有的纤维化疾病，严重影响体表美观并导致功能障碍。成纤维细胞(Fibroblast，Fb)是产生胶原的主要细胞，其异常增殖是病理性瘢痕形成的关键环节。lncRNA在细胞病理活动中发挥着重要作用的大分子非编码RNA，现已成为国内外研究的热点，但在Ps组织Fb生物学行为改变中的角色很大程度上仍是未知的。.内容：本课题基于临床增生性瘢痕组织标本和原代成纤维细胞的基础上，进行lncRNA-seq测序，在组织和细胞水平利用CCK8法、EdU染色、TUNEL染色、流式细胞术、细胞迁移实验等分别探讨了特异性lncRNA FPASL和HSFAS在成纤维细胞增殖、凋亡、迁移和表型转化中的作用；分析lncRNA FPASL DNA启动子区甲基化的改变，筛选并确定特异性甲基转移酶（DNMTs），探寻DNMT3b在增生性瘢痕中对lncRNA FPASL的调控。此外，利用在线软件分析了lncRNA HSFAS和其靶蛋白ADAMTS8之间的结合，RNA pull down和RIP实验明确两者关系。.结果：测序结果发现增生性瘢痕中的特异性lncRNA FPASL和HSFAS，在临床组织标本和细胞水平发现lncRNA FPASL在增生性瘢痕中表达明显降低，lncRNA FPASL过表达可以抑制成纤维细胞的增殖，DNMT3b增加了lncRNA FPASL DNA启动子区甲基化并调控其表达。增生性瘢痕中高表达的lncRNA HSFAS促进成纤维细胞的增殖、迁移和表型转化，抑制成纤维细胞的凋亡，从而参与增生性瘢痕的发生发展，进一步研究发现lncRNA HSFAS通过调控其靶蛋白ADAMTS8发挥作用。.意义：本课题的实施将有利于阐述lncRNA在增生性瘢痕中的表观遗传学机制，揭示了一种新的lncRNA调控机制，为Ps提供了重要的诊断生物标志物和治疗靶点的前景。