芽孢杆菌B1菌株降解4-羟基苯甲酸途径中NIH重排反应研究

4-Hydroxybenzoate (4HBA) is a naturally occurring aromatic compound, but with the extensive use and emissions of 4HBA containing industrial products, it becomes one class of major common organic pollutants. There are three 4HBA catabolic pathways: protocacechuate cleavage pathway, catechol cleavage pathway and anaerobic degradation pathway in anaerobes. Bacillus sp. B1, a thermophilic bacterium, originally isolated from compost, has a lot of catabolic pathways for aromatic compound degradation. The 4HBA catabolic pathway in strain B1 is different from other microorganisms, the benzene ring fisson is through gentisate. The conversion of 4HBA to gentisate includes a reaction called “NIH shift”. Our preliminary study has suggested that CoA ligase, monooxygenase and lyase may be involved in this reaction, but underlying mechanism is still unknown. In this proposed work, we will study on: (1) genes encoding enzymes involved in NIH shift; (2) thermodynamic properties of each enzymatic reaction.Based on these results, we can elucidate a complete mechanism for NIH shift involved in degradation of 4HBA to gentisate, and unveil a role of NIH shift related genes in the global carbon cycle.

4-羟基苯甲酸（4HBA）本来是在自然界中存在的芳香族化合物，但随着含有4HBA的工业产品的大量使用和排放，4HBA已成为常见的有机污染物。微生物降解4HBA的途径有原儿茶酸开环途径，邻苯二酚开环途径和厌氧微生物的苯环开环途径。Bacillus sp. B1菌株是从堆肥中分离出来的嗜热性细菌，拥有各种各样的芳香族化合物降解途径。B1菌株降解4HBA的途径不同于其他常见微生物，是通过龙胆酸开环途径。从4HBA转化为龙胆酸的过程包括一个叫做“NIH重排”的反应。我们在前期工作中预测出有辅酶A连接酶、单加氧酶和裂解酶的参与，但是其反应机制尚不明了。本项目的研究内容是：（1）编码NIH重排反应相关酶的基因研究；（2）各个酶促反应的热动力学特性研究。通过这些研究彻底阐明从4HBA转化为龙胆酸过程中的NIH重排反应全貌，并揭示在自然界中发挥的作用。

对羟基苯甲酸是一种在自然界中广泛存在的芳香族化合物，也是很多天然产物和人工合成化合物的中间代谢产物。从20世纪中叶起，随着社会的发展，石化产品的需求增加，大量的使用这些含有芳香环的石化产品，导致环境中人工化合物的积累超出了自然净化速度，对羟基苯甲酸正是这些人工化合物降解的主要中间代谢产物之一。对羟基苯甲酸的微生物降解一直受到环境工作者的关注。本课题组从堆肥中分离出一个嗜热性芽孢杆菌D1菌株，能够降解包括对羟基苯甲酸在内的各种低分子芳香族化合物。在降解对羟基苯甲酸的过程中龙胆酸作为中间代谢产物被检测出来。从对羟基苯甲酸转化为龙胆酸的过程包含1位的羧基移位到邻位的反应，该反应与一个叫做NIH重排的反应非常类似，但详细反应机制尚不明了。本研究将从代谢产物、酶、基因的水平阐明NIH重排反应机制。. 为了推测NIH重排反应机制，利用粗酶做了一系列实验。以对羟基苯甲酸作为唯一碳源培养B1菌株，当对羟基苯甲酸消耗一半时，收集菌体，破碎细胞后作为粗酶使用。对羟基苯甲酸作为反应底物，在含有粗酶的反应溶液中加入CoA，ATP和Mg2+ 时，利用分光光度计检测到332 nm波长有吸收。在以上反应液中再加入NADPH后，332 nm的吸收消失，利用气质联用色谱检测到龙胆酸的生成。以上实验结果表明从对羟基苯甲酸到龙胆酸的NIH重排反应至少包含有CoA连接酶，单加氧酶，和裂解酶催化的反应。另外本研究还对龙胆酸降解途径进行了研究，推测出一个由龙胆酸双加氧酶、异构酶和水解酶参与的代谢途径，该途径将龙胆酸降解到延胡索酸和丙酮酸。. 为了克隆NIH重排反应相关基因，本研究对D1菌株的基因组进行了测序和注释。B1菌株的基因组大小为3,640,549 bp，预测出2,810个基因。其中编码CoA连接酶基因有20个，单加氧酶基因有10个，裂解酶基因16个，龙胆酸双加氧酶基因有7个。这些基因是否参与对羟基苯甲酸的降解以及NIH重排反应进行了初步研究。