水稻AGO4家族蛋白的功能分化

Small RNAs (sRNAs) are important regulators for gene expression, and have been demonstrated to be extensively involved in development and adaption to biotic and abiotic stresses in rice. When controlling gene expressions, sRNAs must be loaded into ARGONAUTE (AGO) effector complexes and then take effects via the mode of mRNA cleavage, protein degradation or DNA methylation. Most studies so far are focused on characterization and functional exploration of sRNAs in rice, however, molecular investigation of AGO complexes are pretty limited, hindering the wide application of sRNAs in rice breeding. We previously identified a class of long microRNAs (lmiRNAs), which can direct DNA methylation for target regulation through associations with four AGO4 clade proteins in rice. In this project, we will determine the differences among these AGO4 proteins in their functions and action modes, and thereby attempt to answer three critical questions: (1) how do AGO4 proteins recruit different sRNAs in rice? (2) whether AGO4s have mRNA slicer activity and how AGO4s recognize different DNA methylation loci? (3) what specific roles do the different AGO4s have in rice physiology? Our results will not only provide insights into understanding of molecular interactions between sRNAs and their silencing complexes in rice, but also set a theoretic foundation for developing epigenetic approaches for crop improvement.

小RNA是真核生物基因表达的重要调控分子，在植物生长发育和抵御环境胁迫过程中扮演着重要角色。作为小RNA效应复合物的核心组分，ARGONAUTE（AGO）蛋白通过装载小RNA来介导靶基因调控。目前，水稻小RNA的鉴定和功能研究较多，但AGO作用机制研究很少，制约了小RNA在水稻育种中的利用。申请人前期发现了水稻24-nt miRNA进入AGO4s沉默复合物介导DNA甲基化。本项目在此工作基础上，着重阐述水稻四个AGO4家族蛋白作用方式和生物学功能的异同，并力求回答三个重要问题：（1）不同AGO4蛋白如何实现不同小RNA的装载和分拣？（2）AGO4家族蛋白是否具有mRNA切割活性并怎样识别DNA甲基化位点？（3）AGO4家族蛋白不同成员间如何实现其功能分化？ 本研究将为解析水稻AGO蛋白与小RNA互作的分子机制提供直接基础，也可为通过表观遗传手段，改良水稻重要农艺性状提供启示。

小RNA是调控基因表达的重要因子，ARGONAUTE (AGO)蛋白是小RNA发挥功能的重要载体。本项目我们致力于解析水稻不同AGO4家族蛋白成员是否出现功能分化及其调控分子机制。本研究我们通过ago4a和ago16突变体表型观察与全基因组甲基化测序、sRNA测序及转录组测序联合分析，阐述了这水稻两个AGO4s蛋白虽然均偏好结合首位核苷酸为A的siRNA，但其在介导DNA甲基化和调控基因表达等方面存在着功能差异，并最终导致其调控了不同的农艺性状。.通过表型观察，我们发现AGO16正调控水稻籽粒宽度，而AGO4a不参与这一发育调控过程。全基因组甲基化测序结果表明，基因组上一部分位点的CHH甲基化是由AGO4a及AGO16共同影响的，但AGO16比AGO4a具有更多的独立靶标位点。sRNA的比较分析发现，AGO4a与AGO16结合sRNA的特征和数目基本相似，表明AGO16和AGO4a调控 CHH甲基化位点数目的差异并不是由其各自结合的sRNA不同造成的。综合全基因组甲基化测序与sRNA测序结果，我们有意思的发现，进入AGO4a与AGO16的sRNA通过顺式作用与反式作用相结合的方式，高效调控水稻基因组CHH甲基化的稳态。其中，不仅各自结合的lmiRNA可以介导异位DNA甲基化，而且siRNA也可反式调控DNA甲基化过程。此外，我们还发现AGO16可以结合一定的21-nt reproductive phasiRNAs，并调控反式基因表达，但AGO4a不具有此功能。转录组测序分析结果发现，AGO4a蛋白通过CHH甲基化对基因表达调控的效果似乎强于AGO16，但其中的分子机制还不清楚，有待于后续进一步深入。.这些研究结果不仅解析了水稻同一亚家族不同AGO蛋白成员之间功能分化的分子机制，也为利用表观遗传手段，改良作物产量提供了理论依据。