乳移平调控乳腺癌前转移微环境中肺血管完整性的实验研究

前转移微环境的形成是乳腺癌肺转移的关键步骤。肺血管完整性降低，血管通透性提高，为乳腺癌细胞的转移提供有利条件。前期研究发现基于痰毒瘀结病机和散结解毒治则的临床有效方剂乳移平能抑制乳腺癌肺转移，但乳移平对前转移微环境的影响还不得而知，有待深入研究。本项目拟从微环境和细胞两个水平研究乳移平对微环境中肺血管的调控作用及调控机制。在微环境水平上，建立前转移裸鼠模型，研究乳移平调控微环境中肺血管完整性（形态学及通透性）对乳腺癌细胞渗出血管，在微环境中存活及增殖的影响，并探究乳移平对前转移微环境相关因子Angpt1、Angpt2、MMP2、MMP3、MMP9、MMP10的调控作用。在细胞水平上，研究乳移平药物血清对乳腺癌细胞体外增殖的影响，并用分子生物学方法探讨乳移平调控肿瘤细胞TGFβ/Smads信号通路对微环境相关因子表达的影响，阐述乳移平对微环境中肺血管的调控机制。

前转移微环境的形成是乳腺癌肺转移发生发展的关键步骤。本项目从肺前转移微环境入手，研究基于痰毒瘀结病机和散结解毒治则的临床方剂“乳移平”对前转移过程的影响。通过研究乳移平对前转移微环境相关因子和肿瘤细胞因子表达的影响，明确其血管调控机制及肿瘤抑制机制。.我们将小鼠乳腺癌高肺转移细胞4T1接种于BALB/c小鼠乳头脂肪垫上建立乳腺癌前转移动物模型，并用乳移平进行干预。通过比较正常组、模型组和中药组（低、中、高剂量）原位瘤的生长情况，研究乳移平对肿瘤的抑制作用；通过观察各组肺组织的镜下形态（光镜）和肺血管超微结构（电镜），测定各组血管的通透性（依文思蓝法），研究乳移平对前转移微环境形成的影响。通过尾静脉注射4T1/4T1-eGFP细胞，荧光显微镜观察肿瘤细胞在肺前转移微环境中渗出血管、存活及增殖情况；建立TGFβ预处理的4T1细胞前转移模型，通过Western blot和real-time PCR法测定乳移平对TGFβ诱导的前转移因子（Angpt2、VEGF、MMP2、MMP9、S100A8、S100A9）表达的影响，明确乳移平抑制前转移微环境形成的分子调控机制。通过制备含药血清，MTT法测定乳移平对4T1细胞存活率的影响，Western blot和real-time PCR测定乳移平对TGFβ诱导的4T1细胞Smad4、Smad7表达的影响，明确乳移平对乳腺癌细胞的抑制作用和机制。.结果发现乳腺癌前转移时期的建模时间为14天。在前转移时期，肺微环境发生淋巴细胞浸润，毛细血管腔扩张，血管的通透性增强，循环中的肿瘤细胞侵出、存活、增殖能力增强，血管通透性相关因子Angpt2、VEGF以及炎症相关因子S100A8、S100A9表达增强。体内实验发现乳移平能够有效抑制原位瘤的生长，缓解肺部炎症，改善肺血管的损伤，保护血管完整性，抑制肿瘤细胞侵出、存活、增殖，下调TGFβ诱导的前转移因子的高表达，并且存在明显的剂量依赖关系。体外实验发现乳移平含药血清能够有效抑制4T1细胞的增殖，下调TGFβ诱导的Smad4、Smad7高表达。.实验结果表明TGFβ-Smads通路与前转移因子是原位瘤与前转移微环境之间互动的分子机制。乳移平对肿瘤的生长和前转移微环境的形成都有很好的调节作用，它通过抑制前转移因子的表达、保护脉管系统的完整性、阻碍前转移微环境的形成，最终抑制肺转移的发生。