几种碳纳米材料诱导的细胞自噬效应及其毒性作用机制研究

The wide use of carbon nanomaterials (CNMs) in environmental and medical fields has attracted a great deal of concerns on their potential adverse effects on environment and human health. Autophagic cell death has recently become a hot topic in life science, and might be a potential toxic mechanism of CNMs besides apoptosis. In this proposal, we proposed to study the cytotoxicity, autophagy induction and its roles in the toxic mechanisms of three typical CNMs including C60, SWCNTs, and GOs. First, the cytotoxicity will be examined by using a variety of cell viability assays based on different principles and detection procedures including WST-1, flow cytometry analysis and Live/Dead fluorescent staining, to avoid potential interference of CNMs. Simultaneously, the autophagosome accumulation can be detected through TEM, transfection cell model and biochemistry methods. Furthermore, the influence of CNMs on autoflux can be studied by monitoring the abundance of p62 protein and lysosomes, to illustrate the mode of autophagy induction. After that, specific inhibitors and RNAi will be adopted to inhibit CNM-induced autophagy and the subsequent influence on cell viability will be studied to reveal the roles of autophagy in toxic mechanisms of CNMs. At last, the autophagy induction capabilities of CNMs with various shapes and surface functional groups will be compared to shed light on the influential factors of autophagy induction. Study of the relationship between autophagy induction and cytotoxicity will greatly facilitate a better understanding of the toxic mechanisms of CNMs, bring new insights on potential CNMs applications, and provide data for comprehensive and scientific hazard assessment on CNMs.

碳纳米材料的广泛应用使得人们极为关注其环境和健康危害。近年来，细胞自噬性死亡成为生命科学的一个研究热点，可能是碳纳米材料的一种潜在致毒机制。本课题拟研究三种典型碳纳米材料的细胞毒性、自噬诱导及其在细胞毒性机制中的作用。通过一系列细胞活性检测方法考察不同纳米材料的细胞毒性，同时采用电镜观察、自噬检测细胞模型和生物化学方法研究细胞内自噬体的累积；进一步通过考察p62蛋白丰度和对溶酶体的影响来研究碳纳米材料对自噬流的干扰作用，以阐明自噬发生的作用机制。在此基础上，采用抑制剂和基因沉默方法对自噬进行阻断，考察由此引起的细胞毒性变化，以研究自噬的发生在细胞毒性机制中的作用；通过对比不同形态和表面基团的碳纳米材料，研究影响纳米材料自噬诱导能力的因素。阐明碳纳米材料诱导的细胞自噬与细胞毒性的关系将极大地促进对碳纳米材料致毒机制的理解，为碳纳米材料的应用提供新的视野，并对其安全性做出全面客观的科学评价。

碳纳米材料的广泛应用使得人们极为关注其环境和健康危害。细胞自噬性死亡是生命科学的一个研究热点，也可能是碳纳米材料的一种潜在致毒机制。但是自噬在毒性过程中的作用仍不清楚。经过4年的研究，我们系统比较了不同碳纳米材料的细胞毒性、诱导细胞自噬的能力、细胞自噬产生的机制、以及细胞自噬在毒性中的作用。发现，相对于一维的CNT，二维的GO细胞毒性更大，引起细胞自噬体累积的能力也更强，这不是因为它们激活了自噬上游信号通路，而是因为它们能进入细胞的溶酶体后，破坏溶酶体的完整性，从而阻断自噬流，引起自噬体的累积。与CNT和GO不同的是，GQD能诱导细胞自噬上游通路的激活。采用具有不同表面基团的石墨烯量子点研究发现，表面基团对纳米材料引起细胞自噬的能力影响很大，羧基化表面修饰的GQD具有很好的生物相容性，既不引起细胞毒性，也不诱导细胞自噬；而氨基化和羟基化修饰的GQD均具有不同程度的自噬诱导活性，其中hGQD还具有很大的细胞毒性。通过自噬通路的检测也发现，aGQD具有最强的自噬诱导活性，而如果将自噬上游通路进行抑制，则会导致细胞毒性的增加，说明aGQD的自噬诱导具有细胞毒性的保护作用。研究所获得的结果阐明了碳纳米材料诱导的细胞自噬与细胞毒性的关系，将促进对碳纳米材料致毒机制的理解，为碳纳米材料的应用提供新的视野，并对其安全性做出全面客观的科学评价。