内皮细胞特异性细胞连接分子ECSM2的细胞超微结构定位和对生长因子诱导性内皮细胞迁移影响机制的研究

内皮细胞特异性分子2 - ECSM2是一个小分子跨膜蛋白，在不同物种间基因序列保守性较高，特异性表达于血管内皮细胞，在内皮细胞迁移、血管新生以及凋亡过程中发挥重要作用。我们发现ECSM2分子胞外段表达定位于内皮细胞的细胞连接，促进细胞聚集和细胞粘附；在生长因子刺激内皮细胞迁移所涉及的信号转导过程中，ECSM2分子通过影响MAPK-FAK信号轴而抑制生长因子如EGF、VEGF、bFGF刺激所引起的细胞迁移。该申请拟从ECSM2分子的细胞超微结构定位和ECSM2分子对以成纤维细胞生长因子受体FGFR为代表的受体酪氨酸激酶的作用等方面入手，以更深的理解这一内皮细胞特异性的细胞连接分子对生长因子诱导性内皮细胞迁移的影响机制以及和血管稳定性、通透性和血管新生等内皮细胞功能的关系。

目的：探讨内皮细胞特异性分子2（ECSM2）的功能学表位、与其他内皮细胞特异性分子的关系、对内皮细胞功能的影响，以及ECSM2分子在血管新生性疾病的组织学表达，以更深了解ECSM2分子的生物学特点。.方法：.1.利用CBS Prediction Servers生物信息学软件预测ECSM2分子功能学表位；通过定点PCR突变将胞外段第54位酪氨酸突变为丙氨酸（Y54A），构建真核表达Y54A突变的ECSM2表达载体pECSM2 Y54A GFP和pECSM2 Y54A 3FLAG。.2.将真核表达ECSM2 wild type和Y54A突变的质粒分别转染293T细胞，通过免疫荧光和免疫共沉淀检测膜定位和酪氨酸磷酸化；通过划痕实验和跨孔实验检测该突变对细胞迁移的影响。.3.用血管内皮细胞生长因子（VEGF）刺激人脐静脉内皮细胞HUVECs，利用免疫印迹和免疫共沉淀检测ECSM2与VE-Cadherin分子间的关系。.4.将HUVECs细胞接种Matrigel，用Real Time PCR检测体外血管新生过程中ecsm2基因表达水平的变化；用siRNA干扰技术抑制ecsm2基因表达，用Tube formation assay和in vitro permeability assay观察对体外血管形成及血管稳定性的影响。.5.收集46例肝脏恶性肿瘤标本（包括肿瘤组织和癌旁组织），做免疫组化分析，结合病人资料用SAS 9.2软件对数据进行统计分析。.结果：ECSM2分子第54位酪氨酸残基是酪氨酸磷酸化位点，该位点突变不影响ECSM2分子膜定位，但阻遏了ECSM2对生长因子诱导性细胞迁移的抑制，提示该位点参与ECSM2分子对细胞迁移的影响机制；在内皮细胞中，VEGF刺激引起ECSM2与VE-cadherin表达增多，分子间结合增强；功能学上，ECSM2分子促进内皮细胞增殖，维持血管稳定性与通透性；在血管新生性疾病如肝癌组织中，ECSM2分子表达升高。.研究意义：首次发现ECSM2胞外段的酪氨酸磷酸化位点，该位点参与ECSM2分子对细胞迁移的影响机制；在内皮细胞中ECSM2与VE-cadherin存在相互作用，ECSM2分子在肝癌组织中高表达，但具体机制还需深入研究。以上研究对进一步深入理解ECSM2这一新的内皮细胞特异性分子在内皮细胞、血管新生以及疾病发生进展中的作用具有重要意义。