陆生蓝藻发菜耐旱基因调控网络及耐旱特异表达基因的研究

Nostoc flagelliforme is a kind of terrestrial nitrogen-fixing cyanobacterium being strong drought ecological adaptability. The research is aimed at studying theoretically and practically significant drought-resistant molecular mechanism of N. flagelliforme. RNA-Seq, QRT-PCR, gene cloning techniques, genetic transformation and bioinformatics methods will be employed to compare the differences and variation of transcriptome, to analyse gene regulatory pathway and networks with the study results of physiology of N. flagelliforme in response to drought stress. In addition, some speciffically expressed genes in drought-tolerance will be screened, full length will be coloned, subcellular localization and function will be also studied. The research will be of a great significance for understanding molecular mechanism of drought-tolerance in N. flagelliforme and its evolutionary mechanism, will provide a reference for terrestrial cyanobacteria or higher plants in response to drought stress, and will lay a foundation for molecular basis and gene resources of drought tolerance on plant breeding, particularly in corps.

发菜是一种分布在荒漠―半荒漠草原地区的陆生蓝藻，对干旱胁迫具有极强的适应性。针对在理论和实践上有重要意义的发菜耐旱分子调控机理开展研究。以RNA-Seq高通量测序技术、QRT-PCR技术、基因克隆技术、遗传转化技术和生物信息学方法等，比较分析干旱胁迫下发菜转录组变化，结合发菜生理学研究结果，对差异基因表达模式、功能、基因调控路径及作用网络进行分析，构建和解析发菜耐旱的基因调控网络，筛选发菜耐旱关键基因并进行基因克隆、结构预测、亚细胞定位、原核和真核表达并分析其功能。本研究对于阐明发菜耐旱分子机理及进化机制具有重要意义，为陆生蓝藻或高等植物耐旱机理研究提供参考，并为耐旱植物育种（尤其是农作物）提供分子生物学基础和基因资源。

发菜是一种分布在荒漠―半荒漠草原地区的陆生蓝藻，对干旱胁迫具有极强的适应性。针对在理论和实践上有重要意义的发菜耐旱分子调控机理开展研究。以RNA-Seq高通量测序技术、QRT-PCR技术、基因克隆技术、遗传转化技术和生物信息学方法等，比较分析干旱胁迫下发菜转录组变化，结合发菜生理学研究结果，对差异基因表达模式、功能、基因调控路径及作用网络进行分析，构建和解析发菜耐旱的基因调控网络，筛选发菜耐旱关键基因并进行基因克隆、结构预测、亚细胞定位、原核和真核表达并分析其功能。获得了以下研究结果：.（1）获得了发菜转录表达谱；获得了30013560条clean reads，3100个Unigene获得了注释；917个Unigene映射到GO不同功能节点上；有1220个编码基因参与了135条已知的代谢通路。.（2）在干旱胁迫6h和48h处理下分别有392和659个差异表达基因，其中有369和502个基因上调表达，23和157个基因下调表达。功能分析显示，差异基因主要参与光合作用以及淀粉和蔗糖代谢。.（3）构建了发菜干旱胁迫条件下差异基因调控网络图。.（4）克隆了干旱胁迫条件下发菜差异基因nifH、nifD、nifK和NXL-01基因并进行了生物信息学分析。将nifH、nifD、nifK 和NXL-01基因在大肠杆菌中表达，获得预期大小的重组蛋白。.（5）克隆了干旱胁迫条件下发菜差异基因cphB和cphA并进行了生物信息学分析。将cphB基因在大肠杆菌中表达，获得符合预期的31 kD外源重组蛋白。将cphA基因在大肠杆菌中表达，获得了少量符合预期的98 kD外源重组蛋白，并且获得了大量L-精氨酸-聚-L-天冬氨酸结构，表明转cphA基因大肠杆菌体内合成了CphA并催化合成了藻蓝素。亚细胞定位表明CphB和CphA蛋白是典型的细胞质蛋白。构建cphB基因和cphA基因真核表达载体，通过拟南芥蘸花法进行基因转化，T2代转基因植株进行分子验证，表明外源基因插入拟南芥基因组，并且稳定表达。转cphA拟南芥植株抗旱性明显增强。.本研究对于阐明发菜耐旱分子机理及进化机制具有重要意义，为陆生蓝藻或高等植物耐旱机理研究提供参考，并为耐旱植物育种提供了分子生物学基础和基因资源。.