基于固定化靶酶亲和色谱的中药药效物质筛选新方法

Bioaffinity chromatography using immobilized target enzyme, a powerful purification method by taking advantage of the enzyme's unique recognition to ligands and the high separation ability of liquid chromatography, is now the preferred choice for rapid screening of bioactive compounds from taditional Chinese medicines(TCM). Immobilization of target enzyme is the key issue for the screen system. It took the proposer two years to establish an effective immobilization method by the financial support of China Postdoctoral Science Foundation. The synthesized immobilized enzyme derivatives, with the advantage of low nonspecific binding effect, moderate coupling capacity and high stability, have been preliminarily proved to be some kind of suitable affinity materials for screening of bioactive components from natural complex system..In this proposal, α-glucosidase (AGH) is selected as the target protein. After being immobilized on some proper affinity matrix, the AGH derivative is to be used as the stationary phase of a novel bioaffinity chromatography column. Then, a method based on bioaffinity chromatography- high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry is to be established to efficiently screen and identify α-glucosidase inhibitors (AGHI) from anti-diabetes TCM.This novel screening method is supposed to provide a rapid and efficient way to discovery AGHI from TCM. This method may also be a valuable tool for elucidating the material base and therapeutic mechanisms of anti-diabetes TCM.

基于固定化靶酶的亲和色谱筛选模型，具有作用机制明确、可从复杂体系直接命中活性单体等优点，是一种中药活性成分快速筛选的新方法。靶酶的固定化是整个筛选体系建立的关键。在中国博士后基金的资助下，经过近两年的研究，申请者建立了一套有效的固定化靶酶的方法，解决了这一关键问题。所制备的固定化酶具有非特异性吸附小、键合量适中、酶活保留强、稳定性高等优点，在实际样品的初步筛选中表现出了较好的性能。本课题拟以α-葡萄糖苷酶（AGH）为靶酶，以降糖中药中α-葡萄糖苷酶抑制剂（AGHI）的筛选为研究范例，在优化固定化AGH合成方法的基础上，制备生物亲和色谱柱，将其与HPLC联用制成亲和SPE-HPLC-MS或AC-HPLC-MS体系，搭建集"成分分离、活性筛选、结构鉴定、作用机制研究"于一体的AGHI筛选平台。本课题的实施，不仅有望建立一个快速的AGHI筛选新方法，还将有助于部分阐明降糖中药的药效物质基础。

针对目前主流的天然活性成分筛选方法中存在的耗时长、工作量大、消耗高等不足，建立了一种基于固定化酶技术的亲和筛选方法，能够快速准确的筛选出具有特定活性的天然小分子，简述如下：.1、设计并成功合成了多种固定化alpha-葡萄糖苷酶载体（包括壳聚糖载体，大孔树脂载体、聚合物整体柱载体、硅胶载体和琼脂糖凝胶载体等），并对各载体进行载酶量和酶活保留的性能优化。综合考察各载体性能后，最终确定硅胶载体和琼脂糖凝胶载体可用于下一步的亲和筛选。.2、应用上述合成的硅胶固定化酶和琼脂糖凝胶固定化酶，结合UPLC-Q-TOF MS技术，构建alpha-葡萄糖苷酶抑制剂的快速亲和筛选模型。利用阳性及阴性模型药物，对所搭建的筛选平台进行性能验证。结果表明，其中琼脂糖凝胶固定化酶能够成功识别出阳性药物，该模型有效。.3、成功建立了体外alpha-葡萄糖苷酶抑制活性检测体系，并对32种降糖中草药及天然产物进行了抑制活性的初筛，并对其中16个有一定活性的品种进行复筛，制备了64种有效提取部位，从中筛选出9种具有明显酶抑制活性的组分，分别是：绿茶水部位、正丁醇部位，香附乙酸乙酯部位、正丁醇部位，火麻仁石油醚部位，僵蚕石油醚部位，山慈菇乙酸乙酯部位，雷公藤正丁醇部位，薏苡仁石油醚部位。.4、将所构建的新型快速亲和筛选模型首次应用于绿茶提取物上，成功筛选出3种活性成分（EGCG，GCG，ECG）。该法快速（数小时内完成筛选）、经济（只需消耗400 uL的绿茶提取液）、准确（通过设置平行空白对照消除假阳性）、灵敏（检出限可低至0.5 ug/mL）、可靠（体外活性验证证明3成分均为具强亲和性的强效抑制剂）。所构建的筛选模型，还应用于香附提取物中，成功命中出5种活性成分（均为二苯乙烯类寡聚物，由于文章尚未发表，成分具体名称暂且保密），结果同样快速、准确、可靠。.5、建立了一种基于GA-SFC（遗传算法-选择频率曲线）的稳健快速的变量筛选方法，该方法可有效避免常规遗传算法初始种群随机化和背景干扰的缺点。该筛选方法的建立，可直接指导我们进一步深入开展天然降糖活性小分子与酶抑制活性之间构效关系的研究，也为活性化合物进一步的结构优化提供依据。.6、我们总计发表了相关科研论文共9篇，其中SCI论文2篇，中文期刊4篇，会议论文3篇，此外还申报了中国发明专利1项。培养博士后1名，硕士生2名。