辣椒脱水素基因CaDHN在低温胁迫下的功能与调控机理研究

Low temperature is one of the major obstacle factor of pepper winter and spring seeding and protection production in our country. DHN proteins play an important role in cold stress. In the previous research we have identified 7 DHN genes in pepper genomic, and the CaDHN1and CaDHN4 genes were strong induced by low temperature. Moreover the up-regulated degree in cold resistance pepper was higher than that of sensitive pepper. However, Whether the CaDHN1and CaDHN4 genes have the cold resistance function and what are the regulation mechanism is still not clear. So in this project we will use the cold resistant pepper line P70 and cold sensitive pepper line B8, utilize the transgenic approach, compare the performance of gene transgenic plants which overexpression and silence CaDHN1 and CaDHN4 in low temperature stress and identified the CaDHN1 and CaDHN4 gene function. At the same time, we will use the promoter activity analysis, yeast one hybrid technology and RNA SEQ technology to identify the upstream and downstream key regulation factors of CaDHN1 and CaDHN4 genes, and elucidate cold resistance regulation mechanism in pepper. Through these research, the results would provide the scientific foundation for recognizing the mechanism of the DHN gene in stress tolerance. Also, they will provide a useful way and new material for stress tolerance breeding about pepper and other crops.

低温冷害是我国辣椒冬春育苗和保护地生产的主要障碍因素，而脱水素在植物低温胁迫中起着重要作用。项目组前期研究发现辣椒脱水素家族含有7个成员，其中CaDHN1和CaDHN4受低温强烈诱导，且抗寒材料上调倍数显著高于低温敏感材料，但其是否具有抗寒功能及调控机理是什么尚不清楚，因此本项目拟以抗寒辣椒品系P70及不抗寒辣椒B8为材料，采用转基因的方法，比较VIGS诱导基因沉默及超量表达CaDHN1和CaDHN4基因后转基因植株在低温胁迫中的表现差异，明确基因功能；同时采用启动子活性分析、酵母单杂技术及RNA-Seq技术，获得CaDHN1和CaDHN4基因上游关键调控因子及低温胁迫下超量表达与对照植株的基因表达变化，阐明CaDHN1和CaDHN4基因在辣椒抗寒中的调控机理。通过以上研究有望为更全面、更深入地揭示辣椒乃至其他植物的抗寒机制作出贡献，同时也可为辣椒及其他作物抗逆分子育种提供新的基因来源。

低温冷害是辣椒(Capsicum annuum L)栽培过程中主要的障碍因素。目前大量研宄表明低温的主要伤害是引起严重的细胞膜系统损伤，而低温胁迫造成的细胞脱水现象是导致膜系统损伤的主要原因之一，其中脱水素(Dehydrin，DHN)是抗脱水胁迫的重要组分。研究表明植物脱水素基因的表达与积累和植物抗逆性之间存在着正相关，超表达脱水素基因可以提高植物抗逆性。项目组前期研究发现辣椒脱水素家族含有7个成员，其中CaDHN1和CaDHN4受低温强烈诱导，且抗寒材料上调倍数显著高于低温敏感材料，但其是否具有抗寒功能及调控机理是什么尚不清楚，因此本项目以辣椒品系P70为材料，采用转基因的方法，比较超量表达及沉默CaDHN1和CaDHN4基因后转基因植株在低温胁迫中的表现差异，明确其功能；同时采用启动子活性分析、酵母杂交，获得CaDHN4基因上游关键调控因子及下游互作蛋白，阐明CaDHN4基因在辣椒抗寒中的调控机理。取得的主要结果如下：.1. 明确了辣椒CaDHN1和 CaDHN4蛋白定位于细胞核和细胞膜上，且VIGS诱导的CaDHN1和CaDHN4基因沉默后经低温和盐胁迫处理，基因沉默植株萎蔫更严重，丙二醛和活性氧含量升高，相关抗性基因表达量下降，耐寒性和耐盐性降低；在拟南芥中超量表达CaDHN1和CaDHN4基因结果相反，提高了转基因植株的耐寒和耐盐性。.2. 分析了CaDHN4基因启动子活性。根据GUS染色分析发现CaDHN4基因主要在叶柄、叶脉、根、叶片上表达，其中茎以及老叶上表达量更高；同时低温、盐、甘露醇、干旱等逆境胁迫及茉莉酸甲酯、水杨酸、脱落酸等激素处理均能诱导该基因表达。.3. 利用酵母双杂筛选出22可能与CaDHN4互作的蛋白，利用酵母单杂筛选并验证CaDHN4基因上游调控因子CaMYB和CaNAC074，初步探明CaDHN4在低温胁迫下的调控机理。.以上结果表明，CaDHN1和CaDHN4基因能通过减少细胞膜损伤，降低细胞内活性氧的含量及诱导相关抗性基因的表达来提高辣椒的耐寒和耐盐性，且CaDHN4可受CaMYB和CaNAC074转录因子调控，与相关蛋白互作来行使其抗寒功能。此结果将为为辣椒及其他作物的抗逆育种提供新的基因资源和思路方法，具有重要的理论意义和巨大的潜在应用价值。