凉州熏醋传统酿造过程微生物群落演替对四甲基吡嗪形成的影响

Using the methods of culture-independent molecular ecology and classical pure culture,the complicated microbial community systems in Koji and vinegar brewing mass will be studied,which are the two key phases influencing vinegar product flavor.Through tracing the dynamic changes of the microbial community in Koji,saccharification, alcoholization and acetification process respectively,the microbial existential state and succession rules of all kinds of microorganisms including moulds,yeasts and bacteria will be obtained.Meanwhile,the changes of the various metabolites related to the characteristic aroma element tetramethylpyrazine in the traditional brewing process of Liangzhou fumigated-vinegar would be monitored by chromatographic techniques.On the basis,by employing the simulation fermentation tests of single strain and combination strains,which include the culturable yeasts and bacteria(acetic acid bacteria,lactic acid bacteria,and spore-produced bacteria),and determining the metabolites produced by each strains in the tests, the metabolic feature and function of the corresponding microbial flora would be elucidated. Furthermore, the effect of microbial community succession on tetramethylpyrazine formation would be clarified.That could provide a scientific basis for further revealing the vinegar aroma formation mechanism and realizing the regulation and control of vinegar aroma.

采用免培养分子生态学技术、结合经典微生物分离培养方法，对凉州熏醋传统酿造过程中影响产品风味形成的关键环节--成品大曲和发酵料醅中复杂的微生物体系进行研究，通过动态跟踪测定大曲、以及糖化、酒化和醋化等酿造阶段微生物群落组成，获得霉菌、酵母菌和细菌各类微生物的存在状态与消长规律，同时利用色谱技术检测凉州熏醋发酵过程中与其特征香气成分四甲基吡嗪（Tetramethylpyrazine）相关的代谢产物变化情况；在此基础上，对获得的主要可培养酵母菌和细菌（醋酸菌、乳酸菌和产芽孢细菌等）进行单菌、以及优势酵母菌与醋酸菌组合的酒化-醋化协同发酵模拟试验，并比对发酵料醅中代谢产物变化情况，明确相应微生物种群的代谢特点和功能、及其演替作用对四甲基吡嗪形成的影响，为进一步揭示食醋风味形成机理、以及实现酿醋过程香气定向调控提供科学依据。

如何将传统食醋酿造过程香气成分产生的规律与大曲及其酿造体系中彼此共存、顺序生长和代谢互补的特定功能微生物群落的代谢活动及酿造工艺联系起来，探明酿造过程中微生物群落演替作用及其代谢活动对产品特征香气成分四甲基吡嗪形成的影响，是揭示凉州熏醋风味形成机理、及研究香气定向调控的关键。本项目采用免培养高通量测序分析技术、结合经典微生物分离培养方法，对凉州熏醋传统酿造过程中影响产品风味形成的关键环节--酿造大曲和发酵各阶段料醅（糖化、酒精发酵和醋酸发酵阶段）中微生物多样性及其演替规律进行了系统分析，同时利用色谱技术动态跟踪检测酿造过程中与其特征香气成分四甲基吡嗪相关的代谢产物变化情况，通过相关性分析探究了主要功能微生物演替对四甲基吡嗪的影响。主要研究成果如下：.1.明确了凉州熏醋酿造过程5株优势菌株（Clavisporalusitaniae,Hanseniasporauvarum, Lactobacillus paracasei subsp.tolerans, Acetobacter pasteurianus ,Bacillus zhangzhouensis）及其组合菌群对食醋风味的影响及其相互关系，模拟发酵试验显示，酵母菌、醋酸菌、乳酸菌、芽孢杆菌均对酿造过程中四甲基吡嗪生成有一定的影响，酵母菌可代谢生成四甲基吡嗪的前体乙偶姻和2,3-丁二醇，而醋酸菌、乳酸菌和芽孢杆菌均可利用料醅中的营养物质代谢生成四甲基吡嗪,证明其对凉州食醋特征风味物质形成起到决定性作用，可为进一步揭示食醋风味形成机理、以及实现酿醋过程香气定向调控提供科学依据。.2.筛选到一株高产乙偶姻（ACT）和四甲基吡嗪（TTMP）的A.pasteurianus C92菌株，ACT产量19.04g/L，TTMP产量3.82g/L。发现该菌株积累ACT的过程属于生长关联发酵类型；推断其发酵产四甲基吡嗪的代谢途径代谢：糖代谢产生的乙偶姻与NH4+、SO4-2反应生成异硫氰酸异丁酯（C5H9NS），之后两分子C5H9NS环化并脱羧脱硫成一分子TTMP。.3.获得一株产乙偶姻葡萄汁有孢汉逊酵母(H. uvarum),产量达到15.24 g/L；人工接种该菌株所酿食醋四甲基吡嗪含量较对照提高了22.1%，增香显著，可作为食醋酿造的增香菌株，具有潜在应用价值，可为传统食醋生产工艺实现现代化改造提供菌株来源和理论参考。