病毒IL-10通过MHC-1类分子抗原加工提呈"操纵子"致鼻咽癌免疫逃逸的机制研究

The EBV infection was one of the important pathogenic factors in nasopharyngeal carcinoma, and vIL-10 can play immune suppress- ion function which was encoded by the gene BCRF-1 of EBV.But what role did vIL-10 play on immune escape in nasopharyngeal carcinoma cells was still not clear. Our earlier research found that vIL-10 was higher expressed in tissue of nasopharyngeal carcinoma, which leaded to derangements of T lymphocyte subsets. The expression of TAP-1 was declined in the nasopharyngeal carcinoma cell lines after cultured with vIL-10. Thus , we speculate that vIL-10 may inhibit the expression of a "operon" ,which was MHC-I kind of molecular antigen submits (i.e. TAP-1/2, LMP-2/7, HLA-I) ，so that abate the function of tumor antigen presentation . In our studies , after nasopharyngeal carcinoma cells are cultured with vIL-10 , NF-KB Signal Pathway ((IKKb/IkBa/p65NF-KB) and the "operon"in nasopharyngeal carcinoma cells are examined by methods of RT-PCR, Western Blot, EMSA, ChIP and so on. We expect to explore the mechanism of vIL-10 help nasopharyngeal carcinoma cells do immune escape .Finally，BARF-1 and NF-KB will be silenced through the RNAi technology, so that can promote expression of the" operon", enhance the ability of tumor antigen presentation , achieve the purpose of improving the immune function.

EB病毒感染是鼻咽癌重要的致病因素，其基因BCRF-1编码的vIL-10具有免疫抑制功能。vIL-10在鼻咽癌细胞免疫逃逸中的作用机制尚不清楚。我们前期研究发现鼻咽癌组织中vIL-10高表达，导致T细胞亚群分布紊乱，经vIL-10处理的鼻咽癌细胞株TAP-1表达下降。因此我们推测vIL-10可能抑制MHC-I类分子抗原加工递呈"操纵子" （即TAP-1/2、LMP-2/7、HLA-I）的表达，以减弱机体的肿瘤抗原提呈作用。本课题通过RT-PCR、WesternBlot、EMSA、ChIP等方法研究vIL-10处理后鼻咽癌细胞NF-KB通路（(IKKｂ/IkBａ/p65NF-KB )及"操纵子"的表达，探索vIL-10在鼻咽癌细胞免疫逃逸中的作用机制。最后通过RNAi技术沉默BARF-1和NF-KB基因，上调"操纵子"表达，增强对鼻咽癌抗原的提呈能力，从而达到提高免疫功能的目的。

免疫组化检测发现TAP-1、2,LMP-2、7及HLA-I在鼻咽癌组织中表达均低于鼻咽非肿瘤组织中的表达。RT-PCR检测鼻咽癌组织BCRF-1mRNA的阳性率与鼻咽炎症组织中的阳性率无显著性差异。Western Blot检测鼻咽癌组织vIL-10的表达高于鼻咽炎症组织的表达。 RT-PCR、 Western Bolt检测不同时间段vIL-10处理的鼻咽癌细胞中“MHC-1类分子抗原加工提呈操纵子”的表达。mRNA水平：TAP-1在不同时间点表达无差异； vIL-10作用24h时，TAP-2、LMP-2、HLA-I表达下降；vIL-10作用CNE-1后1h出现LMP-7下降，vIL-10作用CNE-2后6h出现下降。蛋白水平：vIL-10作用24h时TAP-1出现显著下降；TAP-2表达逐渐下降；vIL-10作用CNE-1细胞后，LMP-2、LMP-7在12h时出现显著下降，CNE-2细胞中表现为逐渐下降趋势；只有CNE-2的HLA-I在vIL-10作用24h后，出现显著下降。Western Bolt发现vIL-10抑制p-IKK、NF-κB p-p65的表达，促进IKB蛋白表达。免疫荧光镜观察vIL-10抑制胞浆中NF-κB p65核转位活性。EMSA检测vIL-10抑制鼻咽癌的NF-κB的DNA结合活性。ChIP显示vIL-10可以通过NF-κB抑制CNE-2的TAP-1、2, LMP-2、7及HLA-I基因表达。NF-κB p65 CRISPR/Cas9 KO Plasmid转染CNE-2细胞，构建BCRF-1的过表达载体并转染CNE-2和稳定敲除NF-κB p65的CNE-2。Real time -PCR、Western blot检测TAP-1、2，LMP-2、7，HLA-I的表达。mRNA水平：TAP-1、2、LMP-2、 7：BCRF-1过表达且敲除NF-κB组的表达较BCRF-1过表达组的表达明显降低。HLA-I：各组间表达无差异。蛋白水平：TAP-1、2和HLA-I 在BCRF-1过表达组较对照组降低，而LMP-2、7则相反；TAP-1、2在BCRF-1过表达且敲除NF-κB组较BCRF-1过表达组升高，而LMP-2、7和HLA-I则相反。小结：vIL-10可以通过NF-κB 通路抑制MHC-I类分子抗原加工和提呈的“操纵子”的表达。