拟南芥ABCG14细胞分裂素转运蛋白复合体的鉴定和作用机理研究

Cytokinins are a major group of phytohormones regulating plant growth, development, leaf senescence, immunity and stress responses. In crops, cytokinins play crucial roles in different agriculturally important traits such as yield, quality and stress tolerance. However, in contrast to the well-defined polar transport of auxins, the molecular basis of cytokinin transporter is poorly understood. For the first time, we recently deciphered a half size ABC transporter AtABCG14 (Arabidopsis ATP-binding cassette transporter G family 14) as an effluxer controling the acropetal translocation of root-synthesized cytokinins in the root. But in contrast to its well-known physiological role in the root, the direct evidence of AtABCG14 as a cytokinin transporter and its function in the aerial part remain to be eluciated. As a half size ABC transporter, the AtABCG14 forms a full-size transporter complex with another partner. The preliminary data of a BiFC (Bimolecular fluorescence complementation) assay shows the AtABCG14 transporter complex is heterogeneous. To address above questions, we propose to identify and characterize the interaction proteins of AtABCG14 using the Co-IP/MS (Co-immunoprecipitation combined with Mass Spectrometry) method and the split-ubiquitin MYTH (membrane yeast two-hybrid) system. Then the gene expression patterns, protein subcellular localizations and biological functions of the candidate interaction proteins of AtABCG14 will be investigated to screen the genuine partner(s) to form an AtABCG14 cytokinin transporter complex. The candidate partner(s) will be co-expressed with AtABCG14 in a heterologous system such as saccharomyces cerevisiae cells, Sf9 cells, Hela cells or Xenopus laevis oocytes for the transporter activity assay in vitro. The substrates and substrate specificity of AtABCG14 transporter complex will be determined by the transportor assay system using different forms of cytokinins. Meanwhile, the grafting, isotope tracer and cytokinin profiling will be applied to discover the biological function of AtABCG14 and its complex in the aerial part of Arabidopsis. The comprehensive understanding of the mechanism of AtABCG14 complex for cytokinin transport will significantly contribute to the molecular breeding for improving the yield and quality of crops.

细胞分裂素是调控植物生长发育、叶片衰老、抗病性以及非生物胁迫的重要激素，与作物产量、品质以及适应性等农艺性状密切相关。相对于对生长素转运分子机制的研究，人们对细胞分裂素转运的分子机理了解不多。在前期工作中，我们鉴定了植物第一个控制细胞分裂素向顶运输的转运蛋白AtABCG14，但其作为细胞分裂素转运蛋白的直接生化证据和其在地上组织的生物学功能尚不清楚。为解决以上重要问题，本项目拟利用免疫共沉淀结合质谱分析和膜蛋白酵母双杂交两种方法筛选AtABCG14的互作蛋白，研究互作蛋白的时空表达、亚细胞定位和生物学功能，进而利用异源表达系统检测转运蛋白复合体的转运活性及确切底物形式；同时，应用嫁接、细胞分裂素报告基因指示、同位素示踪等方法研究AtABCG14在地上组织的生物学功能。研究结果对于揭示细胞分裂素的运输机理和细胞分裂素在农业分子育种中的应用均具有重要的科学意义和实践价值。

细胞分裂素(CK)是调控植物生长发育、叶片衰老、抗病性以及非生物胁迫的重要激素，与作物产量、品质以及适应性等农艺性状密切相关。相对于对生长素转运分子机制的研究，人们对CK转运的分子机理了解不多。在前期工作中，我们已经证明拟南芥AtABCG14 是一个控制根部CK向顶运输的ABC转运蛋白，但其在地上组织的生物学功能和作为CK转运蛋白的直接生化证据尚不清楚。本研究包括AtABCG14的地上生物学功能和生化功能两方面内容。.1）在AtABCG14地上生物学功能的研究中，atabcg14突变体与野生型嫁接实验证明了AtABCG14 在地上组织的表达对于根部合成CK成功运输到靶细胞是必需的；通过AtABCG14Pro-GUS转基因植物的树脂切片观察，证明了AtABCG14 主要在叶脉的韧皮部和木质部之间的薄壁细胞表达；利用组织特异启动子融合表达AtABCG14 互补atabcg14突变体，发现韧皮部特异表达启动子SUC2pro 和OPT3pro 可以驱动AtABCG14互补突变体表型，但是木质部特异启动子4CL1pro 不能驱动AtABCG14互补突变体表型；通过同位素示踪和激素含量测定等方法确定了AtABCG14在地上组织的生物学功能以及根部CK在地上组织分配的分子机制。.2）在AtABCG14 的生化功能研究中，利用烟草瞬间表达系统和烟草BY2悬浮细胞表达系统，将GFP-ABCG14 融合蛋白瞬时表达或稳定表达，利用LC-MS检测到AtABCG14对tZ类CK有很强的转运活性，而对iP类，cZ 类以及DHZ类CK有相对较弱的转运活性。通过免疫共沉淀结合质谱的方法鉴定了81个互作蛋白，在烟草中用BiFC验证了其中16个蛋白可以和AtABCG14互作，发现互作蛋白AHA1突变体表现出atabcg14 类似表型，其地上组织的ARR5基因表达显著下降。.总之，本研究鉴定了一个AtABCG14互作蛋白，首次明确了CK长距离转运蛋白AtABCG14的底物，阐明了其不仅在根部具有装配CK的功能，而且在地上组织具有再分配CK的功能，揭示了根部CK在根部装配和地上组织分配的相互调控关系，为全面了解根部合成CK的向顶运输机理奠定了基础。