基于蛋白质组学技术对短乳杆菌酒花抗性关键蛋白的研究

Hop resistance is the common characteristic of beer spoilage bacteria, which can be used for fast and exact detection of the spoilage bacteria. Now horA, horC and so on are the key genes representing hop resistance which were applied to detect spoilage bacteria, while HorA and HorC are the corresponding gene expression products of horA and horC which can also be applied for the detection of spoilage bacteria. However, it is limited to determine beer spoilage bacteria by using only one gene biomarker or protein biomarker. So in this project, quantitative proteomics was firstly applied to analyze both the wild hop resistance strains (Lactobacillus brevis 49#) and the hop sensitive strains of Lactobacillus brevis to get the potential biomarkers for the beer spoilage bacteria, which must be the critical proteins in the mechanism of hop resistance. The mechanism of protein action was further studied to make the description of whether the protein expression level or the post-translational modification determined the action of key proteins in the hop resistance mechanism. Moreover the material and energy needed for the key proteins to maintain hop resistance was also demonstrated. This project would promote the research on the both the protein level and post-translational modification level of hop resistance mechanism, and also supply a more detailed description of hop resistance mechanism, which can provide the theory basis for the fast and efficient determination of beer spoilage bacteria.

酒花抗性是啤酒腐败菌的共同特征，利用这一特征可以快速准确地检测腐败菌，有效地减少啤酒工业中的微生物污染带来的经济损失。目前已用于腐败菌鉴别的有酒花抗性基因horA/horC等及其基因表达产物HorA/HorC等，但仅使用单个基因标记物或是蛋白标记物来确定啤酒腐败菌局限性太大，本项目拟以新分离的短乳杆菌（49#菌）为研究对象，通过定量蛋白质组学技术分析酒花抗性的野生49#菌和短乳杆菌的酒花敏感株，得到更多可用于腐败菌鉴定的潜在标记物，即酒花抗性机制中的关键作用蛋白。然后对酒花抗性关键蛋白的作用机理进行研究，从而解释酒花抗性关键蛋白在酒花抗性机理中是靠蛋白表达还是翻译后修饰加工起决定性作用的，另外对关键蛋白维持酒花抗性所需物质和能量也进行阐述。本项目的开展将推动酒花抗性蛋白水平以及翻译后修饰水平的研究，并且能进一步完善酒花抗性多种机理机制的研究，为快速高效鉴定腐败菌提供理论依据。

啤酒是一种微生物稳定性的饮料，但在啤酒生产过程中仍然不可避免会发生微生物污染，从而对啤酒的生产和啤酒的安全构成威胁。因此我们围绕短乳杆菌的酒花抗性机制展开研究。一、研究了异α-酸对L. brevis 49中有机酸，生物胺（BAs），风味物质，碳水化合物和氨基酸代谢的影响。MRS培养基中仅有乙醛酸和甲酸乙酯被消耗，并产生多种有机酸，生物胺和风味物质。加入一系列浓度的异α-酸，L-苹果酸，谷氨酸和精氨酸的消耗以及生物胺的产生有利于增强细菌的酒花抗性。在碳水化合物的代谢中，葡萄糖优于麦芽糖和麦芽三糖，并且异α-酸显着著抑制碳水化合物的利用。二、研究了酒花对L. brevis 49细胞膜组成的影响。随着酒花浓度的升高，短乳杆菌49细胞膜脂肪酸碳链长度增加尤其是C20增长较为明显，平均链长也随酒花浓度的提高而提高；环状脂肪酸C19相较于对照组有显著的增加；在高酒花浓度下,细胞膜脂肪酸不饱和脂肪酸以及支链脂肪酸所占比例随之增加，饱和直链脂肪酸减少；同时U/S值也随酒花浓度的升高而升高。三、为了最大程度上的获取 L. brevis 49 的蛋白质信息，我们分别优化了蛋白质的提取条件以及蛋白质的酶解条件。用正交试验法考察细胞破碎方法，蛋白酶种类，酶解时间，酶添加量四个因素，对L. brevis 49的胞内蛋白提取方法以及酶解方法的影响并进行优化；对培养基氮源进行优化并分别选用 TCA 沉淀法、冷丙酮沉淀法、平衡酚-丙酮法和超滤法对发酵液中的胞外蛋白提取。实验结果表明：提取L. brevis 49胞内蛋白最佳的破壁方法为超声破碎法，胞内蛋白的最佳水解酶为糜蛋白酶和胰蛋白酶共同作用，最佳添加比例为 1:50，最佳酶解时间为 12 h，获得L. brevis 49胞内蛋白最多蛋白数目527个。获得短乳杆菌（49）胞外蛋白最佳培养基为 0.6% 酵母浸粉做单一氮源的 MRS 培养基，最佳提取方法为三氯乙酸（TCA）法，获得44个含信号肽蛋白。