视蛋白对黑素细胞生长、增殖和色素合成的影响及在白癜风发病中的作用机制

Many research studies of vitiligo points to the importance of melanocyte-intrinsic abnormalities as possibly key inducers of the whole inflammatory cascade. At present, the mechanism of the formation of melanocyte-intrinsic abnormalities is not clear.And some recent research suggests that human skin has the ability to detect and respond to UV light using a phototransduction mechanism in melanocytes.Our previous experiments have demonstrated that opsins are expressed in vitiligo lesions at significantly lower levels than those in the repigmentation regions and normal skins of vitiligo patients. In the present study, primary human epidermal melanocytes,which derived from foreskin of children and epidermic grafts of vitiligo lesions,will be transfected with recombinant lentivirus vectors containing OPN2 gene,OPN3 gene,OPN2 miRNA and OPN3 miRNA respectively.Human tissue-engineered skin using all above cells will also be constructed. Gene regulation targeting the endogenous genes is performed with UVR exposure.The effects and mechanisms of gene regulation on the growth, proliferation and melanin synthesis of melanocytes will be examined by Real-time PCR, flowcytometry, western blot,which manifest the role of opsin in the pathogenesis of vitiligo and provide theoretical and experimental evidence for new feasible strategies for the treatment of vitligo.

黑素细胞的内在缺陷是诱发白癜风全部炎性级联反应的关键因素，但黑素细胞内在缺陷如何发生，目前机制不清。近期研究表明，黑素细胞是视蛋白介导的人表皮紫外线光传导受体样信号系统的光受体细胞。本课题组前期研究证实了白癜风皮损区表皮片中视蛋白的表达明显低于复色区及周边外观正常区。本课题以此为切入点，构建含OPN2、OPN3的重组慢病毒载体和含OPN2、OPN3的沉默RNA，然后分别转染正常人表皮黑素细胞和白癜风皮损区黑素细胞，同时分别构建含病毒转染的正常人表皮黑素细胞和白癜风皮损区黑素细胞的组织工程人工皮肤，并用紫外线（UVA、UVB）干预对OPN2、OPN3的表达进行调控，采用real-time PCR、Western Blot、流式细胞术，研究OPN2、OPN3基因调控对黑素细胞生长、增殖和色素合成的影响，阐明相关机制，证实视蛋白与白癜风发病的关系，进一步促进对白癜风发病机制的认识，为未来白癜风的治疗提供一个全新的治疗靶点。

在以往我们研究的基础上，课题组根据国内外研究现状及预实验结果，及时对课题进行适当调整。研究内容主要包括：1）采用实时荧光定量PCR、western blot、细胞免疫荧光及共聚焦显微镜成像检测OPNs在人表皮黑素细胞、表皮角质形成细胞及真皮成纤维细胞中的表达及亚细胞定位，显示OPN3在人表皮黑素细胞、表皮角质形成细胞及真皮成纤维细胞中表达最高，且位于细胞膜上；2）设计针对OPN3的siRNA，采用脂质体介导后转染人表皮黑素细胞，首次证实OPN3具有抗黑素细胞凋亡的固有功能，其通过钙依赖性的G蛋白偶联信号通路和线粒体凋亡途径调控黑素细胞的存活；3）构建人表皮黑素细胞、角质形成细胞即刻共培养模型，证实角质形成细胞来源的TGF-β2通过上调黑素细胞中OPN3的表达，以钙离子依赖的方式促进黑素细胞的黑素合成；4）首次证实长波紫外线（UVA）通过OPN3-钙依赖信号转导通路及下游MAPK/ AP-1信号相关蛋白磷酸化，上调MMP1和MMP3的表达；5）在68例恶性黑色素瘤和166例黑素细胞痣病灶组织中检测出20个OPN3基因的单核苷酸碱基变异（SNV）体，其中包括5个OPN3基因的非同义突变，并且通过预测功能模型表明OPN3非同义突变可能参与黑色素细胞肿瘤的发病机制。该课题首次证实了OPN3维持人黑素细胞生存和调节黑素合成的非感光功能，调节人成纤维细胞UVA光老化的感光功能，以及OPN3在黑色素细胞来源肿瘤组织中的非同义突变和可能的致病作用。