新疆极端耐盐盐生植物盐穗木 microRNAs 的表达和功能性分析

土壤盐渍化和次生盐渍化已严重制约农业生产以及土地资源的有效利用。然而在强度盐渍化环境中又孕育着特殊的生物资源。盐穗木是新疆干旱盐碱荒漠中广布的一种极端耐盐的藜科盐生植物。植株整体耐盐涉及复杂的调控途径，有研究表明植物miRNA在非生物胁迫中发挥重要调控作用。为发现该类植物盐穗木独特的耐盐性，本项目在前期工作基础上，旨建立高盐和非盐胁迫下两个小RNA文库，通过高通量测序和生物软件分析获得该物种保守和特有的miRNA数量和种类；测序的拷贝数数据分析获得盐胁迫下差异miRNA的表达谱并用最新的生物信息软件预测差异miRNA作用的靶基因；qRT-PCR等技术验证并确定候选的差异miRNA和靶基因在盐胁迫下的表达及相关性；进而对候选的5个上调和5个下调的miRNAs遗传转化拟南芥进行耐盐性分析，为深入探讨该物种miRNA的耐盐调控机理和利用miRNA的生物技术改良作物和林木具有重要的理论和现实意义。

土壤盐渍化严重制约农业生产。盐穗木是新疆干旱盐碱荒漠中广布的一种极端耐盐的藜科盐生植物。microRNA (miRNA)是动植物中广泛存在的内源性非编码小RNA分子，在转录后水平负调控靶基因的表达，在植物的生长发育和抵抗胁迫中发挥着重要作用。本课题以盐穗木为研究材料，开展了如下工作。1. 建立了600 mM NaCl处理48 h时该物种根的small RNA文库，并进行高通量测序。获得conserved 和物种特异些miRNA及miRNA的差异表达谱；结合盐穗木的转录组数据，预测了8个盐穗木pre-miRNA和可能的靶基因，GO和KEGG分析表明盐穗木miRNA涉及多个与盐胁迫响应相关的信号通路，包括植物生长素信号转导途径、钙离子信号通路、MAPK信号通路、类黄酮合成等。以上结果表明盐穗木miRNA在盐穗木盐胁迫耐受中可能发挥着重要的调控作用。2. 荧光定量PCR结果验证了盐穗木small RNA深度测序的数据和从small RNA文库候选的表达差异或显著的盐穗木miRNA和预测的靶基因在高盐胁迫的表达模式以及与靶基因的相关性。3. 初探了高盐胁迫下盐穗木幼苗中生长素的响应，以及生长素信号通路中的相关miRNA（miR393b-5p, miR167d-5p与miR160a）与靶基因的RNA水平的表达变化和相关性。4. 细致开展候选的盐穗木miRNA和预测的靶基因(miR156b-SPL16, miR171b-SCL6, miR172e-TOE3, miR169b-NFYA1, miR166a-ATHB8, miR397a-LAC17和miR164a-NAC1）在非生物胁迫中的调控功能研究。采用同源克隆和RACE技术获得了这些miRNA的前体和相应的靶基因；通过生物信息学和5’RLM-RACE、烟草瞬时表达系统等实验手段鉴定这类盐穗木miRNA与靶基因的互作；miRNA前体和靶基因的植物表达载体的构建和农杆菌介导的拟南芥遗传转化技术在分子和生理方面分析这类miRNA与靶基因在盐胁迫中的调控功能。5. 采用生物信息学手段分析了高盐胁迫下盐穗木转录组和数字基因表达谱。6. 探讨了一些盐穗木耐盐生理特性。以上的研究工作对于开展盐生植物盐穗木microRNA的耐盐分子调控和生理机制及利用miRNA的生物技术改良作物和林木，提高生物和非生物抗性具有重要的理论和现实意义。