M3受体在热量限制延缓心肌衰老过程中的作用及其分子机制研究

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death, especially in the elderly population. Old age is a major risk factor for cardiovascular disease. CR has a protective effect on aging heart, but the interaction between CR and the parasympathetic nervous system is not yet clear. New researches show that lower NAD + levels will result in hypoxic cells showed a pseudo-hypoxia state, decreased production of mtDNA, accelerated aging process. Previous study showed that myocardial M3 receptor level was downregulated in aging mouse, while CR could upregulate M3 receptor level; Transgenic overexpression M3 mice showed improved cardiac function and lower fibrotic degree compared with their wild type littermate in the age of 20 month. Besides CR can improve cardiac function in heart failure rat, and M3 receptor specific antagonist 4DAMP can partially reverse the cardioprotective effect of CR. These facts suggest us that M3 receptor may participate in the process of CR induced anti-cardiac aging effect. Thus, we hypothesis that CR can upregulate M3 receptor expression, affect NAD+/Tfam/mtDNA pathway, and then improve mitochondrial function, through which delay the aging of cardiac. This project aims to use transgenic mice, Real-time PCR, Western blot and other molecular biology techniques to explore the role of M3 receptor in cardiac aging delay effect of CR and reveal the molecular signaling pathways. This study will provide a theoretical target for clinical prevention of aging-related diseases.

心血管疾病严重危害人类健康，年龄是心血管疾病发生的独立危险因素。热量限制（CR）具有延缓心肌衰老的作用，但CR与副交感神经系统的相互作用尚不清晰。研究表明NAD+水平降低，导致线粒体DNA生成减少，加速衰老发生。在前期研究中，我们发现衰老的心肌M3受体表达下调，CR可以上调M3受体表达量；20月龄M3受体过表达转基因鼠较相同月龄野生鼠，心脏功能改善、心脏纤维化程度明显降低；且CR可改善心衰大鼠的心脏功能，使用M3受体特异性拮抗剂4DAMP，可部分逆转CR对于心衰的保护作用。据此，我们提出如下科研假设：CR可通过上调衰老时M3受体表达量， 影响NAD+/Tfam/mtDNA通路，改善线粒体功能，延缓衰老发生。本项目拟采用转基因鼠，应用Real-time PCR、Western blot等分子生物学技术，探讨M3受体在CR抗心肌衰老过程中的作用及其分子机制，为临床上衰老相关疾病的新的治疗靶点。

目的：随着人口老龄化进程的加速，各种衰老相关疾病的发生率明显增高，衰老问题是目前关注的热点。大量的实验证据表明，心脏M3受体在维持心脏正常的节律收缩、对抗心肌缺血等生理和病理情况下均发挥着重要的调节作用。M3受体是否参与心脏衰老过程尚无相关文献报道。本文探讨了M3受体对小鼠心脏衰老的影响，以及其调控机制。.方法：1、通过Western Blot及Realtime PCR试验方法，验证在不同衰老模型中，M3受体及Caspase-1及其下游细胞因子IL-1β伴随衰老发生表达量的变化。Caspase-1抑制剂干扰M3受体阻断剂对D-半乳糖诱导的心肌细胞衰老的影响。2、自由采食100％、40％和20％的小鼠，模拟中、重度情况热量限制（CR），评估CR和饥饿对心肌细胞Caspase-1及IL-1β表达的影响。3、建立心衰模型，对比热量限制与正常饮食对心功能的影响，及M3受体阻断剂的干预作用。.结果：1、（1）在各种衰老模型中，M3受体蛋白及mRNA表达水平随年龄增加而降低；（2）老年小鼠相对于年轻小鼠，caspase-1 mRNA和蛋白水平上调；（3）M3受体激动剂胆碱能抑制Caspase-1、IL-1β的表达，4DAMP逆转了这一现象；caspsae-1抑制剂可以缓解M3受体抑制剂的作用。2、CR和饥饿以程度依赖方式降低小鼠体重。饥饿组显示明显的心肌纤维化，对照组和CR组无明显变化。CR抑制caspase-1的激活以及IL-1b和IL-18的表达。相反，饥饿却起着完全相反的作用，组织学结果与之相一致。3、阻断M3受体逆转CR对心衰大鼠心脏功能及线粒体功能的改善作用。. 结论：1、衰老时M3受体表达下调，衰老的心肌细胞Caspase-1及其下游产物IL-1β表达明显增加，M3受体对老化过程Caspase-1及IL-1β表达的变化具有调节作用。2、CR能够减轻焦亡，而饥饿促进焦亡的进程。3、CR通过上调M3受体表达调节衰老发生。提示了M3受体可能为临床中治疗衰老相关的心血管疾病提供新的靶点