胞外多糖介导母乳源植物乳杆菌WLPL04定殖于仔鼠肠道的作用研究

Human milk is an important carrier of probiotics. The role of Lactobacillus plantarum from human milk in the intestinal colonization and physiological effects of infants was rarely reported, and the study on the role of exopolysaccharide (EPS)-mediated adhesion and colonization of human milk lactobacilli in infants was blank. Previously, we isolated a Lactobacillus plantarum strain from healthy human breast milk, named WLPL04, which showed high capability of adhesion and colonization that correlated with the high production of EPS. We speculated that this effect was mediated by EPS, which related with the composition and structure of EPS. In this project, to further investigate the impact on adhesion, colonization, and immunomodulation of EPS on infants, laser confocal microscopy, qPCR, Miseq sequencing, ELISA, and flow cytometry will be used. Furthermore, different EPS gene knockout mutants will be constructed, and the effects of mutants on colonization will be analyzed by cell model and animal model using HPSEC、GC-MS, NMR, TEM and AFM. The expected results of this project will provide underpinning for revealing the molecular mechanisms of colonization of Lactobacillus plantarum WLPL04 in infants, and serve as a new clue to study the function of human milk derived probiotics on infants' health.

母乳是益生菌的重要载体，来源于母乳的植物乳杆菌在婴幼儿的肠道定殖及其生理作用过程中的影响研究鲜见，而胞外多糖介导母乳源乳杆菌在婴幼儿肠道黏附定殖更是空白。申请人前期获得母乳源植物乳杆菌WLPL04，其黏附能力与胞外多糖合成能力呈正相关，推测多糖介导了菌株黏附，且与其组成和结构相关。本项目拟通过孕鼠模型，以仔鼠为研究对象，借助激光共聚焦、qPCR、Miseq测序、ELISA和流式细胞仪术等方法，进一步明确胞外多糖在母乳源植物乳杆菌定殖于仔鼠肠道、肠道菌群发育和免疫调节中的作用。并在此基础上构建不同EPS基因敲除突变体，借助HPSEC、GC-MS、NMR、TEM、AFM、细胞及动物模型等研究手段，分析结构、组成不同的胞外多糖对菌株定殖的影响，为阐明胞外多糖在植物乳杆菌WLPL04通过母鼠传递给仔鼠并于仔鼠肠道定殖的分子作用机制奠定基础，为母乳源益生菌与婴幼儿健康的相关研究提供新思路和有效途径。

母乳是益生菌的重要载体，来源于母乳的植物乳杆菌在婴幼儿的肠道定殖及其生理作用过程中的影响研究鲜见。本项目对母乳源植物乳杆菌WLPL04进行荧光标记，通过构建孕鼠模型，在孕期和哺乳期对母鼠进行菌株灌胃干预，明确了植物乳杆菌WLPL04能够在母鼠肠道内定殖并移位至乳腺，亦可定殖于仔鼠肠道并促进仔鼠早期生长发育。.采用高通量测序分析植物乳杆菌WLPL04对仔鼠肠道菌群组成的影响，发现孕期及哺乳期干预可增加仔鼠肠道微生物丰富度，且随着年龄增长其物种多样性呈规律性增长。采用ELISA及免疫荧光等方法分析，发现植物乳杆菌WLPL04可显著提高仔鼠血清免疫反应，增加仔鼠脾脏CD4+ T的细胞数量及比例，明确了植物乳杆菌WLPL04促进仔鼠免疫系统发育的作用。.借助HPSEC、GC-MS、TEM、AFM、细胞模型，分析植物乳杆菌WLPL04的重要次级代谢产物及表面活性物质胞外多糖的结构、组成及在菌株定殖、发挥功能中的作用：植物乳杆菌WLPL04的EPS分子量为66.1kDa，单糖组成为木糖、葡萄糖和半乳糖构成，摩尔比为3.4:1.8:1；微观结构显示EPS为片状具有光滑表面的致密结构。植物乳杆菌WLPL04胞外多糖可促进菌株黏附定殖，并拮抗致病菌黏附。活性作用研究发现，其可显著促进巨噬细胞增殖，显著增强巨噬细胞的吞噬作用，促进巨噬细胞分泌炎症因子及NO，且经其刺激后的巨噬细胞上清可显著抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞凋亡。.此外，植物乳杆菌WLPL04孕期及哺乳期干预可有效预防金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎，并在仔鼠断奶期有效拮抗致病菌的感染。本项目结果为母乳源益生菌与婴幼儿健康的相关研究提供新思路和有效途径，并为母乳源益生菌在乳腺炎及婴幼儿健康中的应用奠定基础。.