羟基红花黄色素A干预兔骨髓基质细胞MAPK信号转导机制的研究

本课题以健康成年白兔骨髓基质细胞为研究对象，以中医传统理论为指导，采用羟基红花黄色素A干预激素诱导后骨髓基质细胞的方法，从组织形态学、生物化学和分子生物学的角度，通过羟基红花黄色素A对兔骨髓基质细胞MAPK信号转导通路中关键因子Cbfα1、ERK 1/2、JNK、P38mMRA表达影响的体内和体外实验，阐明羟基红花黄色素A对兔骨髓基质细胞MAPK信号通路的作用靶点，以及体内实验和体外实验作用靶点的相关性，为羟基红花黄色素A促进激素性股骨头坏死成骨分化提供新的研究思路与方法，进一步阐明激素性股骨头缺血性坏死的发病机制以及羟基红花黄色素A干预的作用机理，为该病临床治疗药物的开发奠定理论基础。

本课题以健康成年白兔骨髓基质细胞(BMSCs)为研究对象，从在体、离体两方面探讨红花提取物主要成分羟基红花黄色素A（HSYA）干预激素诱导的股骨头缺血坏死兔模型股骨头及离体兔BMSCs MAPK信号转导通路的作用机制。.项目的完成情况：.在体实验中，健康成年白兔48 只，随机分为空白组、模型组，模型组臀肌注射醋酸泼尼松龙制备股骨头缺血坏死模型。造模成功后将模型组兔随机分为模型对照组、髓芯减压组、生理盐水+髓芯减压组、HSYA+髓芯减压组，各组采取相应干预后，腹主动脉采血，检测各组兔血清中碱性磷酸酶、甘油三脂含量；取出股骨头，光学显微镜、透射电子显微镜观察股骨头的形态结构；免疫组化法检测股骨头JNK1的表达；荧光定量PCR法检测股骨头Cbfal及I型胶原 mRNA的表达； Western Blotting检测股骨头ERK、JNK 和p38蛋白的表达。.离体实验中，健康成年白兔20只，分离、体外培养BMSCs，流式细胞仪检测细胞表面标记物。取第3代BMSCs随机分为空白组，模型组及HSYA低、中、高剂量组。模型组用大剂量地塞米松诱导BMSCs成脂分化，HSYA低、中、高剂量组加入地塞米松的同时分别加入不同浓度的HSYA。6 d后，采用透射电子显微镜观察细胞的形态结构，检测细胞内碱性磷酸酶、甘油三脂的含量，荧光定量PCR法检测细胞中Cbfal及I型胶原 mRNA的表达，Western Blotting检测细胞中ERK、JNK 和p38蛋白的表达。.取得的成果：.统计数据，分析得出：（1）HSYA能促进激素性股骨头缺血坏死模兔体内成骨标志物碱性磷酸酶、Cbfal、I型胶原的表达，抑制成脂标志物甘油三脂的表达，抑制激素诱导股骨头髓内BMSCs成脂分化，促使其成骨分化。其次能上调BMSCs MAPK信号通路中与增殖关联的ERK的表达，下调凋亡相关联的JNK、p38的表达，促进股骨头髓内BMSCs增殖，抑制其凋亡。（2）HSYA能促进激素诱导的离体BMSCs成骨分化调控基因Cbfα1、Collagen-I mRNA表达，促进离体BMSCs成骨分化；同时激活MAPK信号转导通路，上调通路中与增殖关联的ERK的表达，下调凋亡相关联的JNK、p38的表达，促进离体BMSCs增殖，抑制其凋亡。