脊髓FTO介导NLRP3 mRNA m6A修饰在CFA致小鼠慢性疼痛中的作用研究

Spinal cord neuroinflammation is a key factor to maintain chronic pain, thus it is of great clinical significance to explore its mechanism. The N6-methyladenosine (m6A) of mRNA modification plays a key role in the regulation of gene expression, especially inflammation related genes. Our previous study showed that the complete Freund's adjuvant (CFA) could decrease the level of m6A in spinal cord of mice. While the FTO, which was a demethylase of m6A, increased in CFA treatment group. And the expression of Nod-like receptor protein 3 (NLRP3) was enhanced in spinal cord induced by CFA. Bioinformatics analysis showed that m6A methylation binding site existed on NLRP3 mRNA. Thus, we propose the following hypotheses: “FTO-mediated m6A demethylation upregulates the expression of NLRP3 in spinal cord, and maintaining the neuroinflammation induced by CFA”. This study aims to investigate the role of spinal cord NLRP3 mRNA m6A demethylation mediated by FTO in chronic pain by behavioral, morphological and molecular biology methods in vivo, so as to provide new ideas for the mechanism and drug development of chronic pain.

脊髓神经炎症是维持慢性疼痛的关键因素，探讨其机制具有重大临床意义。mRNA 6-甲基腺嘌呤(m6A)甲基化修饰在基因(尤其是炎症相关基因)的表达调控中起重要作用。课题组前期结果显示在完全弗氏佐剂(CFA)诱导慢性疼痛模型中，小鼠脊髓m6A水平降低，m6A去甲基化酶FTO表达升高，Nod样受体蛋白3(NLRP3)表达升高，生物信息学分析显示NLRP3 mRNA上存在m6A结合位点。因此，本项目提出以下科学假说：“FTO介导的m6A去甲基化通过促进NLRP3炎性小体的表达，从而维持CFA所致慢性痛小鼠脊髓炎症反应，诱发小鼠痛觉过敏”。基于以上假说，本课题拟从行为学、形态学和分子生物学等方面在体探讨FTO介导m6A去甲基化上调NLRP3的表达在CFA致慢性痛脊髓神经炎症中的作用，为慢性痛的机制研究和药物开发提供新的思路。

慢性疼痛影响了全球约1/5的成年人，严重影响患者的生活质量。然而对于慢性痛的治疗，目前临床上仍缺乏特效的治疗手段。因此，深入挖掘慢性疼痛的机制以及寻找有效的镇痛药物靶点具有重要的临床意义。NLRP3炎性小体诱导的脊髓炎症级联反应是诱导疼痛的关键原因，因此本项目我们首先探讨NLRP3炎性小体的抑制剂MCC950在疼痛中的作用，结果发现MCC950腹腔注射可通过抑制脊髓即早基因和炎症因子的表达，从而改善甲醛诱导的急性炎性痛和CFA诱导的慢性炎性痛，提示MCC950可作为疼痛治疗一个有效分子；m6A是一种RNA转录后修饰，目前的研究显示m6A修饰参与多种疾病进程，但是在CFA诱导疼痛过程中m6A水平及m6A修饰的靶基因尚不完全明确，因此本项目我们利用m6A-ELISA技术首先明确CFA诱导脊髓m6A水平下降，m6A甲基化酶WTAP表达下调而m6A去甲基化酶FTO表达上调；进一步我们利用m6A芯片技术分析CFA诱导小鼠脊髓m6A修饰的靶基因，并对这些靶基因进行分析，同时验证TRPV5可能是CFA诱导疼痛过程中m6A修饰的关键靶基因，提示m6A修饰改变参与CFA诱导疼痛过程。慢性疼痛不仅会诱导痛感觉，还会诱导痛相关的抑郁样情绪。因此，本项目的第三部分，我们探讨了m6A的激动剂甜菜碱干预对CFA诱导痛相关抑郁样情绪的影响。结果发现甜菜碱可显著改善CFA诱导痛相关的抑郁样行为，在机制探讨中，我们发现甜菜碱可抑制小鼠海马小胶质细胞向促炎的M1型极化，而促进小胶质细胞向抗炎的M2型极化，提示甜菜碱可通过抑制小鼠海马小胶质细胞极化从而改善CFA诱导痛相关抑郁样行为。