基于RNAi沉默BDNF mRNA 靶标研究开心散及其活性成分的抗抑郁作用机制

综合目前现有资料和我们前期对开心散抗抑郁作用机制的研究基础，提出激活BDNF 的表达变化是开心散及其主要成分以及抗抑郁药物发挥抗抑郁作用的启动靶点这一假说。本研究拟以实验动物BDNF的表达和功能改变为切入点，通过对动物脑内海马BDNF使用RNAi 进行干预，沉默BDNF mRNA，建立BDNF表达抑制的抑郁动物模型，观察其行为学表现，观察脑区BDNF及相关分子的表达以及海马神经的发生规律，观察BDNF与其受体对下游信号分子及相关神经递质受体如TrkB、5-HT 受体、NE 受体等指标的变化，同时观察开心散及其活性成分、阳性对照药物（临床使用抗抑郁药物）干预后的影响，验证上述假说。期望能够阐明开心散及其有效成分，以及抗抑郁药物激活脑源性神经营养因子发挥抗抑郁作用的机制，明确其可能作用的具体靶点或参与调节的信号传递途径。

本研究使用RNA干扰技术沉默动物海马齿状回区BDNF靶基因，期望阐明BDNF在抑郁症发病中的分子机制以及经典复方开心散对RNAi沉默BDNF基因后的影响作用及分子机制。.我们首先在体外构建了四条能表达针对BDNF外显子的shRNA干扰序列的慢病毒载体，分别转染到自然表达BDNF的大鼠神经胶质瘤细胞（C6）中，通过qPCR和Western Blot观察这四种慢病毒干扰载体对BDNF表达的抑制效果，结果发现LVshBDNF-3序列的干扰作用最显著。为进一步验证LVshBDNF-3的干扰效应，我们采用无血清体外培养SD新生大鼠原代海马神经元，用细胞免疫荧光方法对神经元鉴定纯度后，LVshBDNF-3转染原代神经细胞后，qPCR和western blot检测LVshBDNF-3转染的海马神经元细胞BDNF基因相对表达量和蛋白表达量，并观察开心散对其的影响。结果表明LVshBDNF-3在原代细胞上也有很好的干扰作用，而开心散能明显增加BDNF的表达。.在体内研究中，我们将LVshBDNF-3和阴性对照载体微量注射到SD大鼠双侧海马DG区，通过一系列行为学实验（糖水偏嗜、旷场和水迷宫）评价沉默大鼠海马特定区域BDNF对行为学的影响。结果表明，微量注射LVshBDNF-3后第十天开始，海马BDNF蛋白表达就出现了降低，同时动物体重、糖水偏嗜、旷场评分均明显减少，提示动物表现出明显的抑郁状态；Morris 水迷宫试验结果显示，沉默海马DG区BDNF后能导致大鼠空间学习能力的显著下降，但未减低大鼠的记忆能力；在该模型上，开心散表现出了明显的作用，它促进模型大鼠体重的增加和糖水的摄入量，显著提高水平运动和垂直运动得分，改善抑郁症状；并且增加模型动物海马BDNF的表达；Morris 水迷宫试验结果显示，开心散能够明显修复RNAi所致的DG区BDNF沉默大鼠获得性学习能力的损伤，但对空间记忆保留方面的损伤未观察到明显的修复作用。.本项目的完成表明内源性BDNF的减少能导致抑郁症的发生；LVshBDNF沉默动物脑内BDNF的作用是可逆的；为抑郁症发病的神经营养假说提供了直接的证据。经典古方开心散能够明显拮抗LVshBDNF-3沉默所致的低表达的海马BDNF水平，其机制之一是通过促进未完全沉默的BDNF基因表达，并通过其它相关信号通路的激活，发挥其多组分、多靶点、多途径的抗抑郁作用。