兔胚胎干细胞体外和体内诱导分化精子细胞研究

干细胞体外定向诱导分化是干细胞研究领域的热点和难点，比如诱导发生减数分裂生成精子细胞就是研究的热点之一，但是成功率极低，目前仅在小鼠上成功且得到后代。本研究拟用雄性兔胚胎干细胞诱导分化，研究启动减数分裂生成精子细胞，验证精子细胞受精能力。试验以精原干细胞荧光表达载体Stra8-DsRed-Sv40-NEO转染胚胎干细胞，经G418筛选，用牛磺酸（RA）诱导分化，用流式细胞仪分离分化后的精原干细胞，再转染减数分裂荧光载体Prm1-GPF-Sv40-NEO，筛选转染阳性精原干细胞，进行体内和体外试验。体外继续用RA诱导分化，体内通过移植到模型兔睾丸内进行自然诱导。观察减数分裂生成精子细胞的形态、效率、精子的受精能力和胎儿发育情况，以及监测影响减数分裂的细胞质因子Stra-8和BMP-4的表达变化。目的是建立体外诱导兔胚胎干细胞发育为精子细胞有效程序，为加快家畜育种提供新模式。

干细胞是生命科学的研究热点，有巨大的科研价值与应用前景。本研究以日本大耳白兔为实验动物，研究兔胚胎干细胞的分离培养，传代，条件优化以及启动减数分裂产生性细胞（精子），对创新动物繁育技术和丰富现代生殖生物科学有重要意义。本项目主要从以下几方面开展研究并且得出以下结果：首先建立兔胚胎干细胞建系研究，特别是通过独创的胚胎干细胞层与滋养层剥离方法，极大的提高了兔胚胎干细胞的分离效率，并且所获胚胎干细胞能稳定传代，而且经免疫组化和分子生物学鉴定，完全符合胚胎干细胞特性。本课题组已经获得兔干细胞稳定传代32代以上，为后续研究奠定基础；其次诱导胚胎干细胞分化研究启动减数分裂产生精子细胞。经过视黄醇(RA)诱导试验，发现对兔胚胎干细胞启动减数分裂产生精子细胞效果显著。优化视黄醇的诱导浓度，发现添加0.2mM，30%的细胞染色体是单倍体，表明已经启动减数分裂；兔睾丸细胞产生精子的系统发育研究发现，日龄120日前，兔已经产生精子，也即发生减数分裂。为经后开展移植胚胎干细胞诱导启动减数分裂奠定基础；此外利用胚胎干细胞培养液副产品临床治疗动物开展试验，也属首创，并且发现干细胞分泌液对修复机体有显著的效果；并且对兔早期卵母细胞成熟和激活开展研究，发现3月龄内的母兔也可以获得高质量和数量的胚胎，此时的卵巢卵母细胞成熟效率也高。本项目的结果为今后开展兔胚胎干细胞和减数分裂提供参考。