腺病毒衣壳蛋白特异性中和抗体性质及血清型特异中和抗原确认的研究

A limitation that has become apparent with the most well-studied adenovirus type 5 (Ad5) vaccine vector is the high titers of naturally occurring Ad5 neutralizing antibodies (NAbs) in human populations, particularly in the developing world. Several rare serotypes of adenovirus have been developed for vaccines and gene therapy vectors. Serotype-specific NAbs are detected by viral vector-based neutralization assays (NA) and have been used in epidemiological studies on the prevalence of pre-existing NAbs to several conceptually interesting vaccine vector candidate types. Although neutralization assays are efficient means for detecting specific antibodies against each Ad serotype, they are cumbersome and expensive to perform. Therefore, more simple typing methods for NAbs are needed. Clarify the characteristics of NAbs to adenovirus capsid proteins in human and animal sera will help to design the serotype-specific neutralizing antigen to detect NAbs. Although it is known that Ad5-specific NAbs against three major viral capsid components (hexon, penton and fiber) are generated, differences in the frequency and nature of these pre-existing NAbs remain unclear. In this study, we would examine in detail the Ad5-specific humoral immune response in healthy humans by natural infection to conducive to select typing antigens. And we try to establish a fast, convenient, and accurate typing serological method to detect the adenovirus NAbs in human serum by prokaryotic expression of the adenovirus capsid protein functional domain and molecular dynamics simulation. This study may provide useful insights for the future development of Ad-based vaccine and gene therapy.

目前多种血清型腺病毒已被改造为疫苗和基因治疗载体并进入临床研究。针对载体自身的预存免疫使得对人群进行腺病毒中和抗体分型检测十分必要。病毒中和试验由于成本较高、病毒载体操作难度大、受限于一些复制异常的病毒等原因，目前仅限于实验室研究且难以实现对所有血清型腺病毒的检测。利用中和抗原建立的ELISA等免疫学方法是腺病毒中和抗体十分理想的一种检测手段，但由于腺病毒衣壳蛋白特异的中和抗体性质尚不明确，至今仍未发现理想的腺病毒分型中和抗原。本课题在我们前期研究基础上，设计在蛋白水平综合分析腺病毒衣壳蛋白特异的中和抗体性质，再通过血清交叉反应和分子结构模拟鉴定中和抗原表位、筛选分型中和抗原。最后结合标准的病毒中和试验尝试建立一种方便、快速、准确的免疫学分型检测腺病毒中和抗体的新方法，以应用于更多血清型腺病毒感染和中和抗体水平的检测，从而为腺病毒的流行病学研究以及腺病毒载体疫苗和肿瘤基因治疗设计提供帮助。

腺病毒中和抗体的分型检测对于腺病毒感染的临床诊断以及腺病毒载体的人体临床研究和应用均具有十分重要的意义。目前分型检测腺病毒中和抗体主要利用病毒中和试验，然而由于其成本较高、病毒载体操作难度大等原因，该方法目前仅限于实验室研究且难以实现对所有血清型腺病毒的检测。利用分型中和抗原建立ELISA等免疫学方法是腺病毒中和抗体十分理想的一种检测手段，但由于腺病毒衣壳蛋白特异的中和抗体性质尚不明确，至今仍未发现理想的腺病毒分型中和抗原。本课题在我们前期研究基础上，设计开展了以下研究：首先，开展并完成了六邻体等腺病毒主要衣壳蛋白真核表达载体的构建，通过重组获得杆状病毒感染昆虫细胞进行了蛋白的表达与纯化，后续将开展衣壳蛋白特异性中和抗体性质的评价。此外，构建了嵌合型六邻体真核及原核表达载体以鉴定其中和表位。同时，根据前期实验结果，原核表达了A-G等7个亚群的代表血清型腺病毒三聚体形式的knob蛋白并结合中和血清交叉反应，明确了三聚体knob可以作为理想的分型中和抗原，随后结合病毒中和实验建立了一种简单、快速、准确的分型检测腺病毒中和抗体的免疫学新方法，并检测了Ad37等多个血清型腺病毒在中国地区健康人群中的血清阳性率。随后，我们还创新性地通过表达嵌合型knob抗原进一步对C亚群腺病毒knob的中和抗原表位进行了分析鉴定。本课题的研究有助于进一步明确腺病毒的体液免疫机制，并为腺病毒的感染诊断以及不同血清型腺病毒载体在我国的进一步研究和应用提供了依据。