罗非鱼无乳链球菌GlnR因子在谷氨酸代谢中的分子调控机制及其致病相关性研究

Streptococcus agalactiae is a main pathogenic bacterium of tilapia. Glutamate metabolism is one of the important nitrogen metabolism ways for bacteria, and it has been proved that the glutamate metabolism is involved in the pathogenicity of many pathogenic bacteria. GlnR factor is one of the main regulation protein for nitrogen metabolism, and the molecular regulation mechanism of Streptococcus agalactiae GlnR factor for glutamate metabolism, as well as the pathogenicity of the GlnR have never been studied...In our previous work, we found that GlnR could bind the promoter region of glnA gene (glutamine synthase), it indicated that the GlnR might involve in the transcriptional regulation of glnA. Then a hypothetical model of regulation mechanism of the GlnR for glutamate metabolism was brought forword. In order to confirm this hypothesis, we will construct gene deletion mutations of Streptococcus agalactiae, and analyse the influence of GlnR on the transcription of gene involved in glutamate metabolism by real-time fluorescence quantitative RT-PCR; the interactions between GlnR and the promoter region of related gene will be investigated by EMSA; the pathogenicity of GlnR and glutamate metabolism will be researched by tilapia artificial infection test. ..Through this research, we will integrally reveal the molecular regulation mechanism of Streptococcus agalactiae GlnR factor for glutamate metabolism, preliminary clarify the relationship between pathogenicity and glutamate metabolism.

无乳链球菌是危害罗非鱼养殖最主要的致病菌。谷氨酸代谢作为细菌氮源代谢的重要途径，被证明与多个病原菌的致病性相关。GlnR因子是调控细菌氮源代谢的主要蛋白，它对无乳链球菌谷氨酸代谢的分子调控机制以及与致病性间的关系还未被阐明。在前期的工作中，我们发现GlnR可以与glnA基因(谷氨酰胺合成酶)的启动子区结合，初步证实了GlnR参与了glnA的表达调控。在此基础上提出了GlnR对谷氨酸代谢分子调控机制的假设模型。为了证实该假说，我们拟构建无乳链球菌基因缺失突变株，采用荧光定量RT-PCR分析GlnR对相关基因转录的影响；采用凝胶迁移实验分析GlnR与相关基因启动子区的相互作用；通过罗非鱼人工感染实验证实GlnR和谷氨酸代谢与致病性间的关系。通过本研究能较系统的揭示罗非鱼无乳链球菌GlnR因子在谷氨酸代谢中的分子调控机制，初步阐明它与致病性间的关系。

罗非鱼是全球主要经济鱼类之一，现已成为我国出口型养殖规模最大的鱼类。近年来国内主要的罗非鱼养殖区爆发了非常严重的罗非鱼细菌性疾病，病原为链球菌主要为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，如何防治罗非鱼链球菌病已成为农业和渔业管理部门最为关注的问题。.GlnR是一种全局性转录调控因子，属于MerR家族，参与了与多种代谢酶合成、次级代谢以及转运相关的基因的表达调控。其中，GlnR在氮源的代谢调节过程中起到了重要作用。目前国内外都还没有关于无乳链球菌GlnR蛋白在氮源代谢方面的研究报告。.通过本研究我们发现：.(1) GlnR可以与glnPQ和gdhA基因的启动子区的结合，且GlnR与PgdhA的结合位点与GlnR的保守结合位点“5-TGTNAN7TNACA-3”不一致，在PgdhA区域可能存在一个新的结合位点；.(2) 无乳链球菌中GlnA蛋白并不影响GlnR因子与DNA的结合； .(3) glnA、glnP、glnQ和gdhA这4个基因受到GlnR的调控，其中glnA基因受到正调控，glnP、glnQ和gdhA这3个基因受到负调控；.(4) Gln与GlnR-PglnA的结合存在负相关的影响，Glu不影响GlnR-PglnA间的相互作用；Gln和Glu均不影响GlnR-PglnPQ、GlnR-PgdhA间的相互作用；NH4+不影响GlnR与PglnA、PglnPQ、PgdhA间的相互作用；.(5) Gln可以通过减弱GlnR和PglnA间的相互作用来阻遏glnA基因的转录；Gln不影响gdhA、glnQ和glnP的转录；.(6) Glu可以激活glnA基因的转录，也可阻遏gdhA基因的转录，但这并不是通过影响GlnR与目标基因启动子间的相互作用来实现，可能存在其他的机制；Glu不影响glnQ和glnP的转录；.(7) GlnR缺失突变株对罗非鱼的致死率要明显低于野生株，说明GlnR因子与无乳链球菌的致病性之间是存在相关性的。.本研究拟通过系统的科学实验，较全面的揭示罗非鱼无乳链球菌GlnR因子在谷氨酸代谢中的分子调控机制，并初步阐明它与致病性间的关系，研究结果能为进一步了解无乳链球菌的致病机理奠定相关的理论基础。