microRNA-222在骨组织工程中促神经化的研究及机制探讨

During a large bone graft tissue regeneration process, the lack of efficient neuralized vascular network in the center bone area hinders the nutrient metabolism, thus jeopardizing the outcome of newly generated bone quality. Nerve tissue plays a vital role in the formation of bone via controlling the blood flow, regulating the bone metabolism as well as secreting of neurotrophic factors and so forth.Our previously study firstly discovered that miR-222 has the potential to enable hBMSCs to differentiate into neuro-like cells . In the subsequent study, we will further explore the neuro-differentiating effect of miR-222 on human bone marrow mesenchymal stem cells at the molecular level and the molecular mechanism by finding out the target gene of Notch 1and Wnt pathways so as to clarify the positive role of neuralization in bone regengeration. A thermosensitive nanoparticle hydorgel gene delivery system loaded with miR-222 will be applied in animal mandibular defects model in vivo.The nerve growth ,neovascularization and osteogensis will be analyzed and also the regulatory role of nerve in new bone formation would be revealed in this study in oder to acquire better innervated and more vascularized bionic functioning bone tissue. This study of neuralization in bone tissue engineering will make it possible for the repair of large bone defects, and it will also provide thoughts for various research fields such as osseoperception and feedback regulation of stress.

在大块骨的组织再生中，缺乏有效的血管神经网络是影响新生骨组织中心部位营养代谢和骨再生质量的重要原因。神经在骨形成过程中起到控制血流、调节代谢以及分泌神经营养因子等作用，对于新骨形成至关重要。本课题组前期研究显示miR-222具有促进人骨髓间充质干细胞的神经向分化潜能。据此，本研究将进一步探讨miR-222在分子水平对骨髓间充质干细胞的神经化促进作用，并通过深入研究 miR-222经Notch1和Wnt等通路的作用靶点，研究促神经化分子机制及神经化在骨再生中的作用。利用长期缓释miRNA的温敏纳米凝胶，本研究将miR-222缓释应用于动物骨缺损模型，观察骨缺损区域的成神经、成血管和成骨状况，进一步揭示促神经化对血管新生和骨再生的调控作用，进而获得骨组织工程中接近仿生效果的血管神经化新生骨。骨组织工程中促神经化的研究有望优化大块骨缺损的修复，也有助于应用到骨感知、应力反馈调节等多个研究领域。

本研究利用microRNA222的促干细胞神经向分化潜能，探索了新生神经对形成仿生组织工程骨的促进作用。研究显示miR222可在分子水平促进骨髓间充质干细胞的神经向分化。其机制为通过WNT/β-catenin/NLK通路促进干细胞神经向分化，而NLK是miR222的靶基因。基因和蛋白水平检测结果显示，转染了miR222的骨髓间充质干细胞内靶基因NLK表达下调，而β-catenin表达上调；siRNA敲低靶基因NLK后，神经相关基因表达升高。敲低NLK的蛋白水平和免疫荧光验证，神经相关蛋白Tuj1表达升高。过表达靶基因，qPCR及Western Blotting检测神经相关基因和蛋白的表达降低，过表达NLK的蛋白水平验证，神经相关蛋白Tuj1表达降低。本研究开发了介孔二氧化硅（MSN）接枝miR222后的水凝胶缓释系统。透射电镜实验显示miR222/MSN微球直径约为200nm，凝胶阻滞实验显示MSN与miR222质量比为15：1时，包载能力达到最好；模拟细胞内释放miR222能力的研究显示，免疫荧光检测包载miR222的MSN水凝胶材料6h后可进入人骨髓间充质干细胞内。体外缓释实验显示MSN水凝胶对药物的缓释周期可在35天达到80%。利用温敏可缓释性能的介孔二氧化硅水凝胶材料作为载体，将其应用于骨组织工程中，可促进骨缺损处形成伴有新生神经组织的新生骨，其机制可能是通过miR222促神经纤维分泌CGRP，诱导骨缺损处干细胞分化形成新生骨。本研究还扩展进行了锶离子通过免疫调节促进成骨及成血管的作用及机制研究，明确了锶离子对巨噬细胞的作用特点，探索了锶促进巨噬细胞M2型极化的机制。锶离子可通过结合CaSR受体，提高磷酸化蛋白p-Erk，p-JNK和p-p38表达水平，进而激活MAPK信号通路，促进巨噬细胞M2型极化。锶离子可刺激巨噬细胞分泌BMP2，OSM来促进骨髓间充质干细胞成骨向分化，表达VEGFa和MMP9来促进血管形成。本研究通过骨组织工程中促进早期神经化的研究，可获得富有神经分布的新生骨，还为构建免疫调节功能性血管化骨再生支架材料及其为实现具有骨感知的功能化骨等临床应用提供了新的途径。