LPS对破骨细胞自噬活性的调控及其在感染性骨不连的作用及机制研究

Infected nonunion accompanied by multiple sinuses, soft tissue defect, multiple resistant bacteria, complex malformation, is still very challenging for the orthopedic surgeon. Treatment often lasts months to years and involves repeated surgeries, infection recurrence, high cost, and long-term pain, which seriously affect the health of human beings. At present, gram-negative bacteria are the most common pathogenic bacteria of bone infection in China. The mechanism of infection nonunion resulted from gram-negative bacteria is not clear. Fracture healing is a process of bone reconstruction, in which，endochondral ossification is important. We recently found that blocked endochondral ossification resulted from abnormal autophagy may play key role in dwarfism. Because of the close relationship between autophagy, bacteria infection and osteoclast formation, we hypothesized that autophagy plays an important role in the infected nonunion caused by gram-negative bacteria (LPS). In order to identify the process, we employed clinical specimens, cell lines and animal models to analyze the possible function and mechanism with intervention of autophagy or AMPK/mTOR pathway. This study will clarify the role and mechanism of autophagy regulated by LPS in the regulating the formation of osteoclast and bone resorption, providing the experimental data for the development of autophagy-based treatments against LPS-mediated infected-nonunion.

感染性骨不连常伴有窦道、软组织缺损、多重耐药菌感染、复杂畸形，是创伤骨科急需解决的治疗难题。虽有较多治疗方法，但是存在治疗周期长、多次手术、感染复发、费用高及患者长期痛苦等问题，严重影响人类健康。骨折的愈合是骨重建的过程，软骨内成骨是其中主要骨形成方式，前期我们发现自噬活性的异常可能是软骨内成骨受阻导致侏儒的重要原因，因此，我们推测自噬在骨折愈合中发挥重要作用，结合自噬在细菌感染、破骨细胞形成及功能中的重要作用，我们推测革兰阴性菌（LPS）所致感染性骨不连中，自噬对破骨细胞形成及功能的调控可能具有重要意义。为此，我们分别从临床标本、体外细胞系、感染性骨不连动物模型分析自噬异常导致的破骨细胞形成及功能异常在LPS所致感染性骨不连中的作用，结合干预自噬及AMPK/mTOR信号通路，从体外及体从体外该过程的可能机制，明确调节自噬活性对LPS所致感染性骨不连的治疗效果，为改善其治疗提供实验依据。

感染性骨不连因存在治疗周期长、感染复发、费用高及长期痛苦等问题，是创伤骨科急需解决的治疗难题，严重影响人类健康。早期研究发现骨感染病原菌主要是革兰阳性菌，但随着时间的推移及研究的深入，国内外报道均发现革兰阴性菌的比重越来越大，超过了50%。我们通过对我院开放性创面病原菌分布进行分析，发现开放性创面及骨折发生感染的主要致病菌为革兰阴性菌，占比达65%以上。因此，探索革兰阴性菌所致骨感染骨不连发生机制具有重要的临床意义。骨折的愈合是骨重建的过程，感染性骨不连中，破骨细胞活性相对增强，破骨与成骨失衡，结合自噬在细菌感染、软骨内成骨、破骨细胞形成及功能中的重要作用，我们推测革兰阴性菌（LPS为主要毒力因子）所致感染性骨不连中，自噬对破骨细胞的调控可能具有重要意义。为此我们利用LPS模拟构建炎症模型，分析自噬在LPS所致破骨细胞形成分化异常中的作用及机制。我们发现在该炎症模型中，破骨细胞形成分化的确是增强的，同时自噬活性标志物ATG5、ATG5-ATG12与LC3蛋白表达也是增加的，这提示了自噬的确参与了该过程。通过进一步使用自噬抑制剂氯喹，我们发现抑制自噬活性可缓解LPS所致的破骨细胞形成分化增强，这说明了自噬活性的增强的确是LPS所致破骨细胞形成分化增强的原因。结合前期文献报道AMPK/mTOR信号通路与LPS、自噬、破骨细胞功能存在密切关系，我们推测AMPK/mTOR信号通路可能是LPS、自噬活性及破骨细胞形成分化调控关系中的可能机制。为此，我们检测了该信号通路标志物p-AMPK 的表达，发现LPS处理后p-AMPK 表达增加，说明该信号通路的确参与了该过程。我们进一步使用该信号通路抑制剂Compound C，发现抑制该信号通路可降低LPS所致的自噬活性增强，缓解破骨细胞形成分化的增强。综上所述，我们的研究证实了LPS的确通过激活AMPK/mTOR信号通路，促进破骨细胞自噬活性，从而导致破骨细胞形成分化增强，这可能是骨感染骨不连的发生机制之一。自噬抑制剂氯喹作为常见药物，极大可能成为骨感染骨不连治疗的新策略，我们的研究为改善其治疗提供了实验依据及新的研究方向，具有重要价值。