基于miR-19/PTEN信号轴探讨六神丸抑制肺腺癌细胞上皮-间质转化（EMT）的机制研究

Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a key process in the metastasis of lung adenocarcinoma cells. In our preliminary studies，we found that miR-19 promote EMT in lung adenocarcinoma cells for the first time, and its mechanism may be related to the inhibition of miR-19/PTEN signal axis. Liushen pills can inhibit the metastasis of lung adenocarcinoma, EMT in lung adenocarcinoma and miR-19/PTEN signal axis. Based on the pathological characteristics of miR-19/PTEN signal axis and our preliminary studies, we hypothesize that Liushen pills inhibit EMT in lung adenocarcinoma cells by acting on miR-19/PTEN signal axis.In this project, molecular biological technology and small animal in vivo imaging technology are taken to investigate the role of miR-19/PTEN signal axis in Liushen pills inhibiting EMT in lung adenocarcinoma cells from cellular and animal levels.This project aims to further elucidate the mechanisms of lung adenocarcinoma metastasis, seek therapeutic targets for the metastasis of the lung adenocarcinoma, enrich the mechanisms of traditional Chinese medicine anti-lung adenocarcinoma metastasis, and thus to discover a new way for prevention and treatment of lung adenocarcinoma metastasis.

上皮-间质转化(EMT)是肺腺癌细胞转移的关键途径。本课题组前期研究首次发现miR-19具有促进肺腺癌细胞EMT作用，其机制可能与抑制miR-19/PTEN信号轴有关；六神丸具有抑制肺腺癌转移、肺腺癌细胞EMT以及miR-19/PTEN信号轴作用。基于miR-19/PTEN信号轴的病理学特性和本课题组的前期研究成果我们提出假说：六神丸通过作用于miR-19/PTEN信号轴抑制肺腺癌细胞EMT。本课题中我们将从细胞和动物水平，采用分子生物学、小动物活体内成像技术对miR-19/PTEN信号轴在六神丸抑制肺腺癌细胞EMT中的作用进行研究。本项目将有助于深入阐明肺腺癌转移机制，发掘肺腺癌转移的治疗靶点，丰富中药治疗的疗效机理，为肺腺癌转移的防治探索一条新的思路和途径。

本研究在国家自然科学基金青年科学基金项目资助下对miR-19/PTEN在六神丸抑制肺腺癌细胞上皮-间质转化（EMT）中的机制进行研究。本研究利用非小细胞肺癌（NSCLC）细胞株、分子生物学技术以及小动物活体内成像等多种研究方法，构建了NSCLC体内外实验研究模型。本研究发现：荧光报告分析显示PTEN是miR-19的靶基因，利用RNA干扰技术抑制PTEN、过表达miR-19引起NSCLC细胞呈间充质细胞样形态，上皮细胞分子标记表达降低，间充质细胞分子标记表达升高，细胞增殖减弱，细胞侵袭、迁移以及抗凋亡能力增强；提示PTEN参与miR-19诱导的NSCLC EMT、迁移和侵袭。六神丸含药血清能够有效抑制miR-19触发的A549细胞迁移、促进细胞凋亡；六神丸激活了过表达miR-19的A549细胞中Sestrin2、E-cadherin、PTEN等分子的表达。活体内小动物成像显示与过表达miR-19的肺腺癌细胞移植瘤小鼠相比，六神丸干预的过表达miR-19的肺腺癌细胞移植瘤小鼠肿瘤较过表达miR-19的肺腺癌细胞移植瘤小鼠肿瘤体积减小（P<0.05），肿瘤发生远处转移不显著。TUNEL法检测结果显示六神丸干预的过表达miR-19肺腺癌细胞移植瘤中组织TUNEL阳性细胞数较过表达miR-19肺腺癌细胞移植瘤组织升高（P<0.05）。免疫组织化学法检测结果显示与过表达miR-19 NSCLC移植瘤组织相比，六神丸干预的NSCLC移植瘤组织中E-cadherin、PTEN表达升高，Ki-67阳性细胞数、Vimentin表达降低。Western blot法检测结果显示过表达miR-19 NSCLC移植瘤的E-cadherin、PTEN表达降低，Vimentin、Snail、c-myc、p-P70S6K1、p-4E-BP1表达升高；六神丸干预的过表达miR-19的和无过表达miR-19 NSCLC移植瘤E-cadherin、PTEN表达升高，Vimentin、Snail、c-myc、p-P70S6K1、p-4E-BP1表达降低。以上研究结果表明六神丸通过miR-19/PTEN信号轴抑制了NSCLC细胞的转移和抗凋亡能力以及发生EMT。本研究丰富了传统抗癌中药治疗NSCLC的疗效机理，以及为中医药防治肺腺癌转移提供了新的理论依据。