基于比较转录组分析的米尔贝霉素产生菌的时序性代谢途径改造

Streptomyces bingchenggensis, with self-owned intellectual property rights, produces the milbemycins in industry, which act as the biological pesticide. The complete genome of Streptomyces bingchenggensis has been sequenced, and its digital gene expression tag profiling (DGE) has been completed. And a mutant strain with high yield of milbemycins was obtained by physical and chemical mutagenesis technologies. Based on the previous results, the comparative transcriptomics between the high-yield strain BC004 and the wild type strain BCW1 will be carried out, by which the comparative map of metabolic pathways between the two strains will be drawn. Then the targets genes of metabolic engineering will be estimated by the comparative transcriptomics. Two or three genes that are directly involved in the precursors biosynthesis of milbemycins and expressed in diverse levels will be selected as the targets genes. Furthermore, we will screen the time-ordered promoters in accord with the time order of milbemycins production by the digital gene expression tag profiling, and then check those promoters by vector construction, RT-PCR, western blot and in vivo expression of green fluorescent protein. Finally, the strains with higher yield of milbemycins will be constructed by knockout of the targets genes and time-ordered expression of the homologous genes. This study is aimed to pave a profound way for the construction of engineered strains with high-yield milbemycins.

通过基因工程、代谢工程等分子育种手段提高工业菌株的发酵单位产量是抗生素产业研究的焦点。冰城链霉菌是我国具有自主知识产权的生物农药米尔贝霉素工业生产菌株。以冰城链霉菌为研究对象，在已完成冰城链霉菌全基因组测序、数字基因表达谱（DGE）及人工诱变选育得到的米尔贝霉素高产菌株的基础上，对高产菌株BC004和野生型菌株BCW1进行比较转录组分析，构建其KEGG差异代谢网络图，寻找冰城链霉菌代谢工程改造的靶点。选择直接参与米尔贝霉素前体合成及转录水平变化较大的2-3个基因作为靶点，通过DGE数据筛选冰城链霉菌米尔贝霉素生物合成时序的启动子，并利用载体构建、RT-PCR、Western blot、绿色荧光蛋白体内表达等技术确定合适的时序性启动子，通过靶基因敲除、同源基因时序性过表达方法分别对这些靶点进行基因工程改造，实现米尔贝霉素发酵单位产量的提高，为米尔贝霉素高产工程菌的构建奠定基础。

由于高效低毒、易降解、无环境污染的优良特性，米尔贝霉素在美国、中国、意大利等43个国家和地区被批准用于农作物及花卉的害虫防治，且其半合成药物米尔贝肟被评价为最安全的抗寄生虫药，用于预防及治疗猫、犬类的寄生虫病。随着市场对米尔贝霉素类产品的需求增加，米尔贝霉素原料药的发酵生产及提纯成本却居高不下。本项目利用米尔贝霉素工业生产菌株冰城链霉菌的全基因组、转录组数据，鉴定到三个与米尔贝霉素生物合成基因簇mil共表达的次级代谢物生物合成基因簇kel-typeII PKS，cluster1-typeI PKS, cluster15-otherKS，明确了敲除这三个基因簇中的核心合成基因能够提高米尔贝霉素的产量。另外，在负责黄绿色色素合成的kel簇内发现一个SARP家族转录因子KelR通过结合mil簇内milA1，milA2，milF，milR及kel簇内多个结构基因的启动子区域，激活基因的转录，从而激活米尔贝霉素和黄绿色色素合成的分子机制，确定以自身启动子过表达kelR能够提高米尔贝霉素产量。此外，在cluster15内发现一个细胞色素P450蛋白Cyp41负责米尔贝霉素A3/A4的C26位羟基的形成，明确了敲除cyp41能阻断米尔贝霉素发酵液中顽固的类似物杂质米尔贝霉素α9和α10的合成，同时提高米尔贝霉素产量。最后还发现在冰城链霉菌中负责C6-C8位呋喃环形成的MilE的功能不足是米尔贝霉素A3/A4后修饰来路的一个限速步骤，以自身启动子过表达milE不仅能够减少β族米尔贝霉素的比例，还能提高米尔贝霉素A3/A4及总米尔贝霉素的产量。.总之，本项目在冰城链霉菌中鉴定到6个合适的基因工程改造靶点，不仅有效提高米尔贝霉素A3/A4产量，还成功去除了原料药提纯时难以去除的类似物杂质α9和α10，显著减少了β类米尔贝霉素杂质，去除了发酵液中常伴随出现的水溶性色素，有望从发酵单位产量及分离纯化两个角度降低米尔贝霉素原料药的生产成本。本研究发现的次级代谢物之间在代谢及调控多尺度的复杂关系、链霉菌中首个进行功能确定的CYP268家族蛋白Cyp41及多效转录因子KelR为其他链霉菌的次级代谢物挖掘及工程改造提供理论基础。