Dlk1-Dio3 microRNA簇在大鼠肝卵圆细胞分化为肝实质细胞中的作用及其机制研究

Directional differentiation of liver stem cells provides a rich source of hepatocyte cells for hepatocyte transplantation and bioartificial liver. It is the basis to clarify the molecular mechanism of directional differentiation of liver stem cells for its clinical application. Previous studies and preliminary experiment suggested that some microRNA in Dlk1-Dio3 microRNA cluster increased during hepatic differentiation, and miR-382 promoted the differentiation of hepatic oval cells. This project is to detect the effect of Dlk1-Dio3 microRNA cluster on the morphology, function and molecular marker of hepatic oval cells by using the differentiation model of WB-F344 cell induced by hepatocyte growth factor and 2-AAF/PH rat animal model of hepatic oval cell activation; Furthermore, to clarify the mechanism of Dlk1-Dio3 microRNA cluster, we will detect the expression of epigenetic modification factor and the change of chromatin modification state. In sum, this project aims to address the mechanism of Dlk1-Dio3 microRNA cluster on the hepatocyte differentiation.

肝卵圆细胞的定向分化可为肝细胞移植和生物人工肝提供丰富的肝细胞源。阐明肝卵圆细胞分化的分子机制，是实现控制其定向分化的基础和前提。已有研究和前期实验提示：Dlk1-Dio3 microRNA簇中的microRNA在肝干细胞分化过程中表达上调。预实验证实其中的miR-382可促进肝卵圆细胞的分化。本项目拟利用肝细胞生长因子诱导大鼠肝卵圆细胞WB-F344向肝实质细胞分化的细胞模型和2-AAF/PH大鼠肝卵圆细胞活化的动物模型，从形态学，功能学和分子标志物三方面证实Dlk1-Dio3 microRNA簇对肝卵圆细胞分化的作用；并通过检测表观遗传修饰因子（microRNA的靶基因）的表达及染色质修饰状态的改变，以明确Dlk1-Dio3 microRNA簇的作用机制。本课题旨在明确Dlk1-Dio3 microRNA簇通过调控表观遗传修饰因子促进肝干细胞分化的作用机制。

肝卵圆细胞的定向分化可为肝细胞移植和生物人工肝提供丰富的肝细胞源。阐明肝卵圆细胞分化的分子机制，是实现控制其定向分化的基础和前提。Dlk1-Dio3 microRNA簇是与干细胞分化密切相关的印记基因簇。本研究发现：Dlk1-Dio3 microRNA簇中的多个microRNA在肝干细胞分化过程中表达上调。为了研究Dlk1-Dio3 microRNA簇与肝干细胞分化的相关性，我们建立了肝细胞生长因子（HGF）诱导大鼠肝上皮样干细胞 WB-F344 肝向分化的细胞模型和肝卵圆细胞向肝实质细胞分化的大鼠肝再生模型（2-乙酰氨基芴灌喂+2/3肝切除）。我们发现：表观遗传修饰酶Ezh2和Bmi1以及所修饰的染色质标记H3K27me3等在肝干细胞分化过程中表达逐渐降低，提示Ezh2和Bmi1与肝干细胞分化密切相关。Dlk1-Dio3簇中的miR-382通过抑制组蛋白甲基转移酶Ezh2的表达发挥促分化作用。另外，我们对Dlk1-Dio3 microRNA的上游调控机制做了初步探索，我们在肝细胞和肝癌细胞中发现，Dlk1-Dio3基因簇是受表观遗传修饰调控的，组蛋白去乙酰化酶的抑制剂（HDACi）可提高Dlk1-Dio3 microRNA簇的表达水平。另外，组蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）又是受miR-376a直接调控的靶基因，并且HDAC9 siRNA可提高miR-376a的表达水平。Dlk1-Dio3簇是印记基因簇，其表达受上游母系表达基因区域（Maternally expressed 3, Meg3）的差异性甲基化区域（Differentially Methylated Region，DMR）的DNA甲基化水平调节，结果显示：HDAC9通过提高Dlk1-Dio3上游Meg3区域中组蛋白乙酰化的水平提高miR-376a的表达。因此：MiR-376a和HDAC9存在着互相调控的关系。该研究不仅有利于阐明肝干细胞分化的分子机制，也有利于我们发展分子靶向性的药物来刺激和控制肝干细胞增殖与分化，为肝细胞移植的临床应用奠定坚实的理论基础和实验基础。