牛磺酸对PUMA介导缺血再灌注心肌细胞凋亡的抑制作用

PUMA (p53-upregulated modulator of apoptosis) is recently a pro-apoptotic BH3-only member of the Bcl-2 protein family，and directly binds and antagonizes all known anti-apoptotic Bcl-2 family members to induce mitochondrial dysfunction and caspase activity. CHOP and AP-1 are cooperatively transcriptional factors mediating PUMA expression. PUMA is a critical mediator of cardiomycytes apoptosis induced by ischemia/reperfusion.Taurine has functions of remove free radicals and effects of anti-apoptosis,and protective effect of the ischemia-reperfusion injury of hearts. But it is unclear whether protective effect of taurine on the cardiomyocyte apoptosis is associative with apoptosis pathway mediated by PUMA.Primary cultures of rat neonatal cardiomyocytes were treated with hypoxia/re-oxygenation (H/R). By gene transfection, adenoviral delivery of shRNA, targeted deletion of the PUMA gene, real time-PCR, Western blot and Immunoprecipitation,in the present study we will investigate whether taurine down-regulates expressions of PUMA,CHOP,AP-1,and apoptosis rate, inhibits PUMA directly binding with anti-apoptotic Bcl-2 family members and blocks pro-apoptotic effect of PUMA in the ischemia-reperfusion myocardium, and explore the protective effects of taurine on the cardiomyocyte apoptosis mediated by PUMA pathway, and offer a novel effect target to prevent and therapy diseases including ischemic heart disease and heart failure.

PUMA 是近年发现的促凋亡作用最强的BH3-only蛋白质，能隔离所有Bcl-2家族抗凋亡蛋白质作用，是介导心肌缺血/再灌注（I/R）损伤的关键分子,也是缺血性心脏病防治的新靶点，其表达受AP-1、CHOP等转录因子调控。牛磺酸(Tau)具有清除自由基等抗氧化作用及调节胞内钙稳态等多种功能，对心肌I/R细胞凋亡有很好的拮抗作用，但Tau的抗凋亡作用是否与抑制PUMA过表达和促凋亡作用相关尚不清楚。本课题拟利用PUMA等位敲除鼠建立心肌I/R或H/R模型，用外源转染Ad-PUMA重组体、特异性SiRNA沉默基因及免疫共沉淀技术等，观察Tau对心肌I/R损伤的保护作用与PUMA的关系，Tau对PUMA、CHOP过表达的抑制作用，阐明Tau对心肌中PUMA过表达与促凋亡作用的影响，探讨Tau抗心肌细胞凋亡的PUMA途径及其分子机制，为防治与凋亡有关的缺血性心脏病及心力衰竭提供新的实验依据。

PUMA 是近年发现的促凋亡作用最强的BH3-only蛋白质，能隔离所有Bcl-2家族抗凋亡蛋白质作用，是介导心肌缺血/再灌注（I/R）损伤的关键分子,也是缺血性心脏病防治的新靶点，其表达受AP-1、CHOP等转录因子调控。本课题利用外源转染Ad-PUMA重组体、特异性SiRNA沉默基因等分子生物学技术，从体内和细胞水平两个方面观察了Tau对心肌I/R损伤的保护作用与PUMA的关系及其分子机制，重点研究了用PUMA过表达或特异性SiRNA沉默鼠和野生型小鼠分别建立心肌I/R损伤模型，观察牛磺酸对这两种模型心肌细胞中PUMA、Bcl-2、Bax等凋亡相关基因表达及凋亡影响的差别；用特异性SiRNA沉默PUMA，以Bcl-2、Bax的表达、Caspase-3活性与凋亡率变化为指标，观察沉默PUMA后对牛磺酸在心肌细胞保护作用中的影响；在心肌H/R细胞凋亡模型上，用特异性SiRNA沉默CHOP（或AP-1）表达，观察CHOP（AP-1）表达降低对PUMA表达、Caspase-3活性和凋亡的影响；还观察了牛磺酸对I/R心肌细胞中Caspase-12表达及其活性的影响。结果表明，牛磺酸(Tau) 对心肌I/R损伤细胞凋亡有很好的拮抗作用，对心肌I/R损伤有较好的防治作用；牛磺酸对H/R心肌细胞中PUMA、CHOP、Bcl-2、Bax、GRP78和Caspase-3蛋白表达有不同程度的影响。随着牛磺酸浓度的增加，H/R心肌细胞中促凋亡蛋白PUMA、CHOP、Bax、GRP78和Caspase-3蛋白表达则逐渐下降（P<0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2表达则逐渐升高（P<0.05），特别是对PUMA和CHOP蛋白过表达有很好的下调作用，而PUMA和CHOP蛋白对凋亡有很强的诱导或促进作用，且细胞中CHOP表达水平又会影响PUMA、Bax和Bcl-2蛋白表达，参与调控I/R心肌细胞凋亡。可见，PUMA和CHOP是导致I/R心肌细胞凋亡的关键分子。通过本研究，阐明了Tau对I/R心肌中PUMA和CHOP蛋白过表达与促凋亡作用的影响，PUMA和CHOP是Tau抗心肌细胞凋亡作用的关键靶点分子，证实了Tau抗心肌细胞凋亡的PUMA途径及其分子机制，为Tau用于心衰及缺血性心脏病防治提供了新的实验依据。